膠原肽預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及其作用機制研究進展

劉翼波，李 博

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院, 北京 100083)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨病，其特點為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折等[1]。隨著世界人口老齡化日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥患病率正逐年攀升。最新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國50歲及65歲以上人群的骨質(zhì)疏松癥患病率分別達到了19.2%和32%[2]，骨質(zhì)疏松癥已成為老年人常見的死亡原因之一。導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的根本原因是體內(nèi)雌激素急劇變化、年齡增加等因素造成的骨代謝失衡，最終表現(xiàn)為骨的凈丟失[3]。因此，目前的治療手段主要從促進骨形成和抑制骨吸收兩方面入手來調(diào)節(jié)骨代謝，但較大的副作用往往限制了其廣泛應(yīng)用。如常見的雌激素替代療法可能會增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生風(fēng)險[4]。此外，骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為是“隱形疾病”，前期沒有明顯的臨床癥狀，當(dāng)出現(xiàn)骨折等無法逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重后果時才會引起患者的重視，因此，應(yīng)該更加關(guān)注骨質(zhì)疏松癥的前期預(yù)防。目前普遍使用的骨質(zhì)疏松癥預(yù)防方法為補充鈣劑和維生素D，但對于部分人群來說，僅適量補充效果欠佳，過量補充又可能增加腎結(jié)石與心血管疾病的風(fēng)險[5]，所以急需尋找更加安全有效的骨質(zhì)疏松癥預(yù)防措施。

膠原蛋白是廣泛存在于動物結(jié)締組織中的生物大分子，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白。膠原蛋白經(jīng)蛋白酶水解后降解為多肽或寡肽，因此膠原蛋白酶解物又稱為膠原肽。畜禽源及水產(chǎn)動物源的皮、骨等組織為天然膠原蛋白和膠原肽的主要來源。近年來，從膠原肽中分離鑒定出多種具有調(diào)節(jié)生理功能作用的生物活性肽[6]，如抗氧化肽、抑菌肽等，其中，已有大量體外實驗、體內(nèi)實驗及部分臨床研究表明，膠原肽具有良好的預(yù)防骨質(zhì)疏松癥功效。同時，本課題組的前期研究也表明牛骨膠原肽[7]和鰱魚皮膠原肽[8]均可有效緩解自然衰老小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀。本文將對近年來膠原肽預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的功效評價及作用機制研究進行綜述，為將其開發(fā)為相關(guān)功能性食品提供系統(tǒng)性的理論支持。

1 I型膠原與骨代謝

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)中最重要的纖維結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱等結(jié)締組織中[9]。目前已發(fā)現(xiàn)二十余種膠原蛋白，其中I型膠原(COL1)最為常見[10]，它是由兩條α(I)鏈和一條α(II)鏈構(gòu)成的三螺旋結(jié)構(gòu)，含有重復(fù)的三肽Gly-X-Y結(jié)構(gòu)域(其中X多為脯氨酸，Y多為羥脯氨酸或羥賴氨酸)。骨有機質(zhì)中的主要成分即為I型膠原，它可以影響骨的承重、抗拉強度及鈣化后的扭轉(zhuǎn)剛度等生物力學(xué)特性，其降解和代謝紊亂在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中起重要作用[11]。生活中一些陸生哺乳動物的皮、骨(如牛骨、豬皮等)及魚類副產(chǎn)物(魚皮、魚骨、魚鱗)是常見的外源性I型膠原來源，許多研究發(fā)現(xiàn)其酶解物——膠原肽對體內(nèi)骨和膠原的代謝也發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。

體內(nèi)的骨代謝主要包括骨吸收和骨形成兩部分，由單核巨噬細胞分化而來的破骨細胞(osteoclast，OC)通過分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)、組織蛋白酶-K(cathepsin-K，cath-K)等物質(zhì)來實現(xiàn)對礦物質(zhì)基質(zhì)的溶解吸收以及基質(zhì)蛋白的水解，并釋放I型膠原羧基末端交聯(lián)肽(CTX)、I型膠原氨基末端交聯(lián)肽(NTX)、脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline，DPD)等I型膠原降解產(chǎn)物[12]，最終形成骨吸收陷窩[13]；而由間充質(zhì)干細胞分化而來的成骨細胞(osteoblast，OB)則發(fā)揮骨形成的作用，介導(dǎo)基質(zhì)蛋白I型膠原的合成并釋放I型膠原氨基端肽(PINP)和I型膠原羧基端肽(PICP)[12]，同時通過激活成骨細胞分化和礦化的特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix來調(diào)節(jié)成骨[14]，促進堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)等分化、礦化標(biāo)志物以及鈣沉積的形成。另外，體內(nèi)骨代謝水平也可以從骨密度(bone mineral density，BMD)、骨最大載荷、最大應(yīng)力等生物力學(xué)性能參數(shù)以及決定骨微結(jié)構(gòu)的骨小梁數(shù)目、分散程度、松質(zhì)骨體積、皮質(zhì)骨厚度等方面直觀體現(xiàn)[15]。而膠原肽對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用即可表現(xiàn)為對上述骨代謝指標(biāo)的調(diào)控。

2 膠原肽預(yù)防骨質(zhì)疏松癥功效評價

2.1 臨床試驗功效評價

臨床試驗是評價食品或藥品功效最為直觀、最具說服力的手段，膠原肽防治骨質(zhì)疏松癥的作用在部分臨床試驗中也得到了肯定。劉厚福等[16]研究中對185位老年人進行了為期一年的膳食干預(yù)，規(guī)定每人每日食用6 g海洋魚骨膠原肽粉，發(fā)現(xiàn)魚骨膠原肽可有效改善OP組和非OP組老年人的骨密度及血清骨代謝指標(biāo)，可改善其骨質(zhì)狀況，使其骨代謝趨于正平衡。K?nig等[17]研究表明，已發(fā)生骨密度降低的老年絕經(jīng)后婦女連續(xù)一年每天攝入5 g膠原肽后，其椎骨、股骨骨密度及血清PINP含量均顯著增加。其他類似的臨床研究也證實了膠原肽具有良好的成骨活性[18-20]，可有效促進骨形成、抑制骨吸收。

另外，多項臨床研究發(fā)現(xiàn)患者同時服用膠原肽與補鈣劑可以更好地促進骨形成。如王玉林等[21]以202例絕經(jīng)女性骨質(zhì)疏松癥患者為研究對象，分組對其進行6個月的干預(yù)治療，其中試驗組每日服用10 g骨膠原肽和600 mg鈣爾奇D，對照組每日僅服用600 mg鈣爾奇D。研究發(fā)現(xiàn)，膠原肽的攝入可顯著改善患者骨密度，調(diào)整其體內(nèi)骨代謝的平衡，可以有效地緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥癥狀及其引起的疼痛，且效果明顯優(yōu)于對照組，是一種可行的臨床防治骨質(zhì)疏松癥方案。這也與Elam等[22-23]的研究結(jié)果相一致。

2.2 動物模型功效評價

預(yù)防骨質(zhì)疏松癥功效評價的動物模型多選用去卵巢大鼠，此模型可以模擬女性因絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平急劇下降而造成的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，也是最常見、患者基數(shù)最大的一類骨質(zhì)疏松癥[24]。除此之外，還有部分運用維甲酸模型[25]、地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型[26]、模擬老年型骨質(zhì)疏松癥的衰老模型[7-8,27]等來進行相應(yīng)的研究。雖然以上造模方法均可模擬人體骨代謝失衡及骨質(zhì)疏松癥癥狀，但也存在許多差異，即使是同一種造模方法針對不同的個體也會表現(xiàn)出些許差異。如維甲酸模型雖然可以造成急性骨丟失，但其血清代謝指標(biāo)與實際骨質(zhì)疏松癥患者差距較大，相比之下，地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥模型各項指標(biāo)更加接近真實情況[28]。另外，也有研究表明，去卵巢手術(shù)的效果會隨著小鼠品系及骨骼部位的變化而變化[29]。因此，在選擇造模方法及觀測指標(biāo)時應(yīng)根據(jù)實際需要進行調(diào)整。除各種骨丟失模型外，還有針對正常生長大鼠模型的研究。Takeda等[30]研究發(fā)現(xiàn)適量攝入膠原肽可使生長期大鼠的骨量增加，且每日以運動輔助效果更佳。

另外，現(xiàn)有研究中利用動物模型探究膠原肽成骨活性所用的原料可分為兩大類——膠原肽和膠原肽-鈣復(fù)合物，二者均可表現(xiàn)出對骨代謝的正向調(diào)控作用。

2.2.1 以膠原肽為原料的動物模型功效評價 動物模型功效評價中所用的膠原肽混合物多為自行酶解制備或已商業(yè)化生產(chǎn)的膠原肽產(chǎn)品。膠原肽的攝入可以有效改善模型動物的骨密度、骨小梁微結(jié)構(gòu)，提高骨生物力學(xué)性能，同時改變與骨代謝相關(guān)的生物標(biāo)志物含量及活性。如Zhang等[31]采用去卵巢大鼠模型，使其分別以100、200、500 mg/(kg·BW)的劑量連續(xù)口服12周經(jīng)中性蛋白酶酶解得到的耗牛骨膠原肽，可以觀察到大鼠骨密度、骨微結(jié)構(gòu)、骨代謝水平的改善，且大多表現(xiàn)出劑量依賴性。值得指出的是，去卵巢模型所模擬的為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，即骨形成與骨吸收水平均提高，但總體表現(xiàn)出骨的凈丟失。而術(shù)后補充膠原肽可扭轉(zhuǎn)這一趨勢，降低去卵巢所導(dǎo)致的高骨轉(zhuǎn)換水平，使其骨重建向正平衡狀態(tài)恢復(fù)[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前一個月給小鼠補充膠原肽可有效防止術(shù)后兩周骨密度的下降[33]，這表明膠原肽的攝入可能在人類更年期骨質(zhì)流失開始前就對體內(nèi)骨代謝起到了調(diào)節(jié)作用。滿帥[26]的研究也發(fā)現(xiàn)從造模前四周或造模后開始口服膠原肽均可有效改善地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨質(zhì)狀況，表現(xiàn)出預(yù)防和治療的雙重功效。此外，膠原肽表現(xiàn)出的成骨活性還具有特異性，其作用并非體現(xiàn)在作為某些氨基酸的營養(yǎng)補充劑上。Wauquier等[34]研究表明牛膠原肽飲食組對去卵巢大鼠骨質(zhì)流失的預(yù)防作用顯著優(yōu)于含酪蛋白飲食的對照組。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)攝食鰱魚皮膠原肽對老年大鼠骨代謝的改善顯著優(yōu)于攝食膠原蛋白全水解物或脯氨酸的對照組，這也表明膠原肽的成骨活性并非得益于氨基酸本身。表1為近年來膠原肽在防治骨質(zhì)疏松癥方面的體內(nèi)功效評價(按照發(fā)表年份降序排列)。

表1 抗骨質(zhì)疏松膠原肽體內(nèi)功效評價Table 1 In vivo efficacy evaluation of anti-osteoporosis collagen peptides

2.2.2 以膠原肽-鈣復(fù)合物為原料的動物模型功效評價 膠原肽氨基酸殘基上的羧基、氨基等基團可以與鈣離子結(jié)合形成復(fù)合物，實驗中多用碳酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣等鈣鹽與膠原肽進行復(fù)合。多項研究表明服用二者的復(fù)合物或聯(lián)合服用膠原肽與補鈣劑可有效提高去卵巢大鼠模型動物或低鈣飲食模型動物的骨密度、改善骨生物力學(xué)性能及血清骨代謝指標(biāo)，且其成骨作用往往表現(xiàn)出優(yōu)于二者單獨使用的效果。這可能是由于肽-鈣復(fù)合物的攝入不僅促進了骨有機質(zhì)I型膠原的合成，還同時補充了骨無機質(zhì)鈣鹽，從而促進了二者的附著結(jié)合，即提高了鈣的吸收率，進而更好地促進新骨的形成。表2為近年來膠原肽-鈣復(fù)合物在防治骨質(zhì)疏松癥方面的體內(nèi)功效評價(按照發(fā)表年份降序排列)。

表2 抗骨質(zhì)疏松膠原肽-鈣復(fù)合物體內(nèi)功效評價Table 2 In vivo efficacy evaluation of anti-osteoporosis peptide-calcium complexes

綜上，膠原肽和肽-鈣復(fù)合物對各類骨代謝失衡模型動物均表現(xiàn)出良好的成骨活性，這也為膠原肽的補充提供了更加多樣化和高效化的選擇。

2.3 細胞模型功效評價

體內(nèi)與骨代謝相關(guān)的細胞包括成骨細胞和破骨細胞，有關(guān)膠原肽預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的體外功效評價多針對成骨方面(表3，按照發(fā)表年份降序排列)。成骨細胞負責(zé)骨形成過程中基質(zhì)的合成、分泌和礦化，其在體內(nèi)成熟的過程中有四種不同的形態(tài)，依次為前成骨細胞、成骨細胞、骨細胞和隊形細胞。而針對膠原肽成骨活性的體外功效評價多選用小鼠胚胎前成骨細胞(MC3T3-E1)，用其代替人原代成骨細胞最為可靠[43]。此外，也有部分研究利用人成骨肉瘤細胞系(MG-63)[32,44-45]、人SV40轉(zhuǎn)染成骨細胞(hFOB1.19)[46]、直接從幼鼠體內(nèi)分離的原代骨細胞[26,47-48]或骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)模型[49-50]。BMSCs具有成骨、脂肪、軟骨、神經(jīng)等多向分化潛能，可用于探究膠原肽促進其成骨分化的作用。

膠原肽處理可以促進成骨相關(guān)基因的表達，進而促進成骨細胞增殖、分化、礦化并生成相應(yīng)的生物標(biāo)志物。如Zhu等[51]研究表明豬骨膠原肽中<1 kDa的肽組分可以有效促進MC3T3-E1細胞的增殖，提高成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2及Osterix的表達，進而促進細胞分化，提高分化早期標(biāo)志物ALP的活性，促進細胞外基質(zhì)I型膠原的合成，同時還可以降低細胞的凋亡率，表現(xiàn)出良好的成骨活性。當(dāng)然，影響膠原肽體外成骨活性的原因也是多方面的，如膠原蛋白的酶解條件中加酶量、酶解溫度、pH、酶解時間等會影響膠原蛋白的水解度以及膠原肽的分子量，另外，不同的酶有不同的酶切位點，這也會導(dǎo)致膠原肽序列的不同，而這些差異都會對膠原肽的成骨活性造成一定的影響[52-53]。Ding等[54]研究發(fā)現(xiàn)東方藍鰭鮪魚骨膠原蛋白經(jīng)堿性蛋白酶或胰蛋白酶水解后得到的膠原肽，在促進MC3T3-E1細胞增殖方面表現(xiàn)出較大的差異，前者明顯優(yōu)于后者。同時，多項研究表明膠原肽的分子量與其成骨活性密切相關(guān)。Liu等[55]研究了平均分子量分別為878 Da(CH878)、1370 Da(CH1370)、2900 Da(CH2900)和7747 Da(CH7747)牛骨膠原肽組分的成骨活性。結(jié)果表明CH1370和CH7747可以促進MC3T3-E1細胞中ALP的表達，而CH878則表現(xiàn)出相反的作用效果。但Zhu等[51]將豬骨膠原肽分為<1000 Da、1000～3000 Da、3000～5000 Da和>5000 Da四個組分，分別檢測各組分對MC3T3-E1細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)<1000 Da的低分子量組分效果最佳。

除促進骨形成外，膠原肽在抑制骨吸收方面也有一定的作用，但目前相關(guān)研究較少。已有研究中常用的細胞模型為小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞，此細胞經(jīng)特定誘導(dǎo)劑(多用核因子κB受體活化因子配體RANKL，其被認(rèn)為是破骨細胞形成和分化所必需的細胞因子)誘導(dǎo)后可分化為前破骨細胞。Wauquier等[34]利用含牛膠原肽的小鼠血清培養(yǎng)經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞，有效地抑制了細胞的分化，同時發(fā)現(xiàn)與破骨細胞融合、成熟及活性相關(guān)的基因表達也顯著下降。Hu等[45]的研究也表明鯛魚和虱目魚魚鱗膠原肽可顯著降低經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞培養(yǎng)過程中TRAP的活性，抑制骨吸收。與促進骨形成相比，膠原肽抑制骨吸收相關(guān)的研究明顯不足，但這些研究也表明膠原肽有抑制破骨細胞活性的潛在作用，因此，未來可在此方向進行更加深入的探究。

綜上，膠原肽在促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化以及進一步促進前成骨細胞增殖、分化、礦化方面表現(xiàn)出很高的活性，表明膠原肽很大程度上通過促進骨形成來調(diào)控骨代謝。另外，少數(shù)研究表明膠原肽在抑制破骨細胞活性方面也可以發(fā)揮一定的作用，因此推測膠原肽可以同時調(diào)控骨形成和骨吸收，使得前者大于后者，從而發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的功效。

3 膠原肽預(yù)防骨質(zhì)疏松癥作用機制

已有大量關(guān)于膠原肽預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的體外、體內(nèi)及臨床功效評價研究，其中也有部分涉及其作用機制(表3)，但相關(guān)研究還不夠深入，尤其是具體活性成分、作用受體以及所調(diào)控的信號通路方面的研究還較少?？傮w來看，膠原肽可能通過以下幾個方面來發(fā)揮其成骨活性。

表3 抗骨質(zhì)疏松膠原肽體外功效評價及作用機制Table 3 In vitro efficacy evaluation and mechanism of anti-osteoporosis collagen peptides

3.1 促進成骨細胞定向分化

間充質(zhì)干細胞經(jīng)譜系定向分化為前成骨細胞，前成骨細胞在骨形成過程中經(jīng)歷細胞增殖、分化(細胞外基質(zhì)成熟)和基質(zhì)礦化三個時期，最后形成新骨[62]。多項研究表明膠原肽可對上述定向分化過程的不同階段起到促進作用從而表現(xiàn)出成骨活性。

首先，膠原肽可以調(diào)節(jié)細胞周期，從而起到促進成骨細胞增殖的作用。細胞周期分為間期和分裂期(M期)，其中間期又包括G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期)。另外還有部分細胞處于休眠狀態(tài)暫不分裂的G0期，在適當(dāng)條件的刺激下可重新進入細胞周期。Fu等[46]研究發(fā)現(xiàn)大馬哈魚魚皮膠原肽處理hFOB1.19細胞后可顯著提高S期細胞比例，降低G0/G1期細胞比例，這表明膠原肽可以調(diào)節(jié)細胞周期，促進DNA合成或加快G0/G1期細胞向S期細胞的轉(zhuǎn)化，從而表現(xiàn)出促進成骨細胞增殖的能力。另外，還有研究表明膠原肽處理可以提高G2/S期細胞比例[56-60]、提高Cyclin D1等細胞周期蛋白的表達[51-52]。

此外，膠原肽還可以促進成骨細胞的分化以及骨有機質(zhì)中I型膠原的合成。其中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs，包括ERK1/2、JNK1/2、p38等)的級聯(lián)磷酸化信號傳導(dǎo)發(fā)揮著重要的作用：在膠原肽的作用下，MAPKs被磷酸化激活，之后進一步激活成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix基因及蛋白的表達，促進成骨定向分化，ALP、COL1、OCN等成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達也隨之增加。如Ding等[54]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)膠原肽處理后，ERK1/2磷酸化水平和MC3T3-E1細胞中Runx2的表達顯著提高，且在ERK1/2特異性抑制劑PD98059處理后被顯著抑制，因此表明膠原肽可通過MAPK/ERK信號通路促進成骨。其他相關(guān)研究中也有類似的結(jié)果[32,44,50,58-59]。另外，TGF-β/Smad信號通路在調(diào)節(jié)成骨細胞基質(zhì)膠原合成和代謝中也起著重要的作用[63]。本課題組的前期研究[8]表明口服鰱魚皮膠原肽可提高TGFβ和Smad3蛋白表達量，降低Smad7蛋白表達量，從而通過TGF-β/Smad信號通路促進骨I型膠原的合成；同時，鰱魚皮膠原肽還可提高整合素α2β1受體的表達量，該受體可與I型膠原相互作用從而促進成骨細胞的增殖、分化等，因此推測鰱魚皮膠原肽可通過增強二者的相互作用以達到緩解自然衰老小鼠骨質(zhì)疏松的作用。Seong等[58]從皮氏叫姑魚魚骨膠原肽中分離純化出的三肽KSA可以通過與TGFβ超家族中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)受體結(jié)合而磷酸化激活其下游的MAPKs和Smads信號通路，進而促進ALP、OCN、OPN等成骨細胞分化相關(guān)標(biāo)志物基因的表達，表現(xiàn)出良好的成骨活性。同時，Ye等[64]發(fā)現(xiàn)具有成骨活性的耗牛骨膠原肽中有多條包含GDRGETGPAGPAGPIGPV(GP-16)和GPSGP AGKDGRIGQPG(GD-18)序列的肽段，將上述兩個序列與可能的配體進行分子對接研究發(fā)現(xiàn)二者與表皮生長因子受體(EGFR)有較強的結(jié)合力。EGFR的激活可能在細胞外基質(zhì)的重構(gòu)中起重要作用[65]，耗牛骨膠原肽的成骨活性可能部分歸因于肽段GP-16和GD-18或具有相同氨基酸序列的類似肽段有效地刺激了EGFR并結(jié)合至其活性位點從而加快細胞外基質(zhì)的合成。

3.2 抑制成骨細胞凋亡

除體內(nèi)雌激素的急速下降外，衰老也是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的一個常見原因，其中細胞凋亡發(fā)揮著重要的作用。因此，通過抑制成骨細胞凋亡來延長其壽命可能是一種潛在的防治骨質(zhì)疏松癥的方法[66]。有研究發(fā)現(xiàn)膠原肽對成骨細胞的凋亡有一定的抑制作用，包括降低細胞凋亡率[53]以及抑制Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3等細胞凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達[51]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)又稱為蛋白激酶B，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)磷酸化產(chǎn)物的下游靶點，PI3K/Akt信號通路激活后可促進Bcl-2抗凋亡蛋白的表達進而調(diào)控細胞凋亡，因此該通路成為防治骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵性靶點[67]。小鼠體內(nèi)Akt1的破壞可使成骨細胞的凋亡敏感性增加，從而導(dǎo)致骨密度降低[68]。Zhu等[51]研究發(fā)現(xiàn)豬骨膠原肽可以提高Akt的磷酸化水平，激活成骨細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路，并降低該通路的天然抑制劑PTEN的活性，且經(jīng)PI3K抑制劑LY294002處理后，細胞活力以及Akt磷酸化水平均顯著下降，這也更進一步表明膠原肽可通過PI3K/Akt信號通路抑制成骨細胞的凋亡，從而表現(xiàn)出較強的成骨活性。

3.3 間接調(diào)控破骨細胞活性

核因子κB受體活化因子(RANK)在破骨細胞前體細胞表面高度表達，由多種細胞調(diào)節(jié)合成的核因子κB受體活化因子配體(RANKL)可與其唯一受體RANK發(fā)生特異性結(jié)合，從而促進破骨細胞的增殖、分化，并抑制其凋亡；而由成骨細胞分泌的骨保護素(OPG)與RANK類似，可與RANKL發(fā)生競爭性結(jié)合，從而抑制破骨細胞的分化以及過度的骨吸收[69]。因此，RANK/RANKL/OPG信號通路在骨重建過程中發(fā)揮著十分重要的作用，多項研究表明膠原肽可通過對此信號通路的調(diào)控來間接調(diào)節(jié)破骨細胞的活性，抑制骨吸收。申勇濤[70]研究發(fā)現(xiàn)羊骨膠原肽可通過抑制RANKL及RANK的表達、促進OPG的表達來抑制破骨細胞的分化、成熟以及骨吸收過程，表現(xiàn)出良好的預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的活性。王珊珊[42]的研究也表明鱈魚骨膠原肽可通過抑制成骨細胞RANKL的表達、促進OPG的表達來間接調(diào)控破骨細胞的活性，從而影響骨代謝。這也與Zhu等[51]的研究結(jié)果相一致。

3.4 促進鈣吸收

鈣是骨形成過程中必不可少的礦物質(zhì)元素，鈣的攝入不足或吸收障礙是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一，有研究表明恢復(fù)腸鈣吸收可以減緩骨丟失、改善骨質(zhì)疏松癥[71]。而膠原肽與鈣的復(fù)合物往往表現(xiàn)出優(yōu)于單獨補鈣的成骨功效，這表明膠原肽的攝入有助于提高鈣的吸收利用率。如Zhang等[38]研究中制備了太平洋鱈魚骨膠原肽-CaCl2復(fù)合物，體外單向腸灌注試驗發(fā)現(xiàn)灌注肽-鈣復(fù)合物的腸鈣吸收率顯著優(yōu)于單獨灌注CaCl2，這表明膠原肽可以提高Ca的吸收利用率。后續(xù)去卵巢大鼠實驗中，對照組以Ca2+攝入劑量為200 mg/(kg·BW)的標(biāo)準(zhǔn)服用補鈣劑CaCO3，兩個試驗組分別以Ca2+攝入劑量為100、200 mg/(kg·BW)的標(biāo)準(zhǔn)服用肽-鈣復(fù)合物，結(jié)果表明試驗組大鼠在骨密度、骨生物力學(xué)性能、骨代謝情況以及骨鈣含量、血清鈣含量等方面均明顯優(yōu)于對照組，進一步說明了膠原肽可以通過促進鈣吸收來表現(xiàn)出更好的預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用。這也與多項研究[39-41]的結(jié)果相一致。

目前已有研究中膠原肽發(fā)揮成骨活性的作用機制即可歸類為以上幾種，但對于各種作用機制下，膠原肽具體是通過作用于哪些受體、調(diào)控哪些信號通路中的何種關(guān)鍵節(jié)點蛋白來促進骨形成、抑制骨吸收的，還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論與展望

本文綜述了膠原肽成骨活性功效評價及其作用機制的相關(guān)研究，這些研究結(jié)果均表明膠原肽在促進骨形成、抑制骨吸收、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面有著極大的應(yīng)用價值與應(yīng)用潛力。同時，膠原肽作為膠原蛋白的酶解產(chǎn)物，其生物利用度大大提高，并且是天然食源性成分，具有來源廣泛、安全無毒副作用等各類藥物無可比擬的優(yōu)勢，因此有望推廣成為一種安全有效的預(yù)防骨質(zhì)疏松癥膳食補充劑。但就目前的研究進展來看，還存在一些關(guān)鍵問題需要進一步的探究：

第一，已有多項研究表明相同膠原蛋白來源中不同分子量范圍的膠原肽表現(xiàn)出不同的成骨活性，但尚未有研究者基于此深入探究各種預(yù)防骨質(zhì)疏松癥膠原肽的最佳分子量范圍，未來的相關(guān)研究可由此深入并試圖闡明其中可能的原因；

第二，大多數(shù)已有研究中只說明膠原肽混合物可以發(fā)揮成骨活性，尚未對其中具體的活性成分、關(guān)鍵核心序列進行分離鑒定，這也限制了對其具體作用靶點、作用機制以及量效關(guān)系的精確研究；

第三，已有的針對膠原肽作用靶點的研究多采用計算機模擬分子對接方法，尚未采用特異性干擾SiRNA 轉(zhuǎn)染等實驗進行進一步的驗證。

因此，未來可從以上幾方面入手對膠原肽在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面的作用特點及作用機理進行更加深入的探究，這也可以為今后將其廣泛應(yīng)用至相關(guān)健康輔助食品的開發(fā)提供更加堅實的理論依據(jù)。