大豆拉絲蛋白不同加工方式對高脂血癥小鼠降脂功效的影響

白莉莉，陳玉玲，楊 梅，鄧姝穎，薛 陽，陳 康，蔡慧珍

(寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，寧夏銀川 750011)

隨著生活水平的不斷提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)也逐漸改變，營養(yǎng)性疾病愈發(fā)增多，如高血脂癥、高血糖等營養(yǎng)性疾病嚴重危及到人們的生活質(zhì)量[1]。目前高脂血癥和糖尿病已成為困擾科學界的一大難題。高脂血癥常繼發(fā)于糖尿病、腎病綜合癥等疾病，是動脈粥硬化、冠心病的危險因素之一。因此，控制和降低血膽固醇水平對預防心血管疾病，特別是預防冠心病的發(fā)生和發(fā)展有重要意義。大豆蛋白具有降血脂、降血糖、預防骨質(zhì)疏松、降血壓等多種保健功能，一直以來大豆蛋白制品都受到人們的廣泛關(guān)注[2-3]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，大豆組織蛋白已不能滿足消費者的需求，進而食品研究技術(shù)人員研發(fā)出大豆拉絲蛋白，從質(zhì)地、口感上可以更加滿足消費者的需求[4-5]。

大豆拉絲蛋白是以脫脂豆粕為主要原料，通過熱塑性擠壓形成的組織化高蛋白制品[6]，具有與肌肉纖維相似的黏彈性和咀嚼性，可以替代部分畜禽肉，也可直接加工成素食制品，提高其營養(yǎng)價值或改善其口感[7]。本課題組關(guān)于大豆拉絲蛋白的前期研究也表明，大豆拉絲蛋白素丸子的蛋白質(zhì)含量高、膽固醇低、氨基酸含量高、有豐富的不飽和脂肪酸、營養(yǎng)價值高、口感佳，可以作為傳統(tǒng)肉丸的替代品[8]。

前期研究結(jié)果雖然表明大豆拉絲蛋白丸子膽固醇低、豐富的不飽和脂肪酸，但是大豆拉絲蛋白丸子及不同加工方式對高脂血癥的降脂功效仍不確定。因此本實驗采用大豆拉絲蛋白、大豆拉絲蛋白丸子(油炸)、大豆拉絲蛋白丸子(水煮)(本實驗非油炸加工方式采取水煮方式)三種干預飼料飼喂高脂血癥小鼠，觀察小鼠脂代謝水平、肝功能等指標的變化，探討大豆拉絲蛋白不同加工方式對高脂血癥小鼠脂代謝的影響，為大豆拉絲蛋白在食品領(lǐng)域預防和控制心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘油三酯試劑盒(20190806)、膽固醇試劑盒(20190806)、高密度脂蛋白試劑盒(20190806)、低密度脂蛋白試劑盒(21090803)、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒 均購買于南京建成生物工程研究所；大豆拉絲蛋白 寧夏海納源食品有限公司；高脂飼料 北京中科科奧生物科技有限公司；實驗動物ICR小鼠 寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心，50只，雌雄各半，體重為(20±2)g，飼養(yǎng)在溫度為(22±1)℃、相對濕度50%±5%的SPF屏障環(huán)境中。每組小鼠分籠喂養(yǎng)，每籠5只小鼠，每隔2 d更換一次墊料，每周稱取小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠一般情況；普通飼料 由寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心提供；高脂飼料配方：普通飼料中添加15%豬油，20%蔗糖，1.2%膽固醇，0.2%膽酸鈉；干預飼料：大豆拉絲蛋白、大豆拉絲蛋白丸子(油炸)、大豆拉絲蛋白丸子(水煮)破碎后分別與普通飼料按照2∶3的比例混合而成。

Heal ForceSY50超純水制備機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司； Multiskan GO全波長酶標儀 美國THermo公司；自動組織脫水機 湖北康強醫(yī)療器械有限公司；生物組織包埋機 泰維科技有限公司；石蠟切片機 美國Thermo公司；正置顯微鏡 德國Leica顯微系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高脂血癥小鼠造模、分組和干預 40只ICR小鼠高脂飼料飼喂6周。禁食12 h后尾靜脈取血, 測定血清中TC水平,當小鼠的TC水平高于正常水平(2.35～3.53 mmol·L-1)，表明高脂模型小鼠造模成功(《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范 (2003版)》)。將造模成功的小鼠隨機分為4組(n=10)，分別為高脂模型組、大豆拉絲蛋白組、大豆拉絲蛋白丸子(油炸)組、大豆拉絲蛋白丸子(水煮)組。大豆拉絲蛋白丸子(油炸)由大豆拉絲蛋白 35%、大豆分離蛋白5%、水30%構(gòu)成，含鹽、蔥、姜、蒜少量。使用熔點為 24.6 ℃、煙點為 192 ℃的棕櫚油油炸生產(chǎn)加工[8]。大豆拉絲蛋白丸子(水煮)由大豆拉絲蛋白35%、大豆分離蛋白 5%、水30%構(gòu)成，含鹽、蔥、姜、蒜少量。使用沸點為 100 ℃的飲用水生產(chǎn)加工。對于造模成功的高脂血癥小鼠，每種干預飼料每只籠盒每天限量12.5 g，飲水自由攝入。另取10只ICR小鼠作為正常組，飼喂普通飼料。造模成功后，干預7周，乙醚麻醉后，眼球取血，留取肝臟、附睪周脂肪組織放入-80 ℃超低溫冰箱備用[9]。

1.2.2 小鼠一般情況的觀察 每周稱取并記錄各組小鼠體質(zhì)量，觀察其體質(zhì)量變化情況，各組小鼠活動情況、皮毛光澤程度及精神狀態(tài)。

1.2.3 肝組織病理學檢查 將分離的小鼠肝右葉組織塊，放置于預冷的4%多聚甲醛溶液中，避光固定24 h。肝組織固定好后，用雙面刀片將組織塊修剪成合適大小，流水沖洗3 h。按照設(shè)定好的程序進行脫水透明浸蠟操作，11 h 后取出。放置石蠟包埋機中進行包埋，冷卻后用切片機制成 4 μm連續(xù)切片，置于載玻片上，進行常規(guī)HE染色。利用光學顯微鏡觀察各組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的病理變化。

1.2.4 血脂和肝功能指標的測定 按照試劑盒提供的方法檢測小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT。

1.2.5 計算肝臟指數(shù) 各組小鼠摘眼球取血后，冰上分離小鼠的肝臟，置于生理鹽水中清洗，去除血污，濾紙拭干，稱重并計算肝臟指數(shù)。計算公式為[10]：肝臟指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。

1.2.6 附睪周脂數(shù) 各組小鼠眼球摘血后，冰上分離小鼠的附睪周脂，置于4 ℃生理鹽水中清洗，去除血污，濾紙拭干，稱重并計算附睪周脂指數(shù)。

計算公式[11]：總脂肪重量(g)=附睪脂肪重量(g)+周圍脂肪重量(g)；附睪脂肪指數(shù)(%)=總脂肪重量(g)×100/體重(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 建立小鼠高脂血癥模型

由圖1可知，高脂飼料干預6周后，高脂模型組的血清膽固醇水平5.96 mmol/L顯著高于正常組的血清膽固醇水平2.94 mmol/L(P<0.01)。參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003版》，小鼠TC水平均高于正常水平(2.35～3.53 mmol/L)，表明高脂血癥小鼠造模成功。

圖1 造模第六周正常組與高脂血癥模型組的血脂水平Fig.1 Blood lipid levels in normal group and hyperlipidemia model group at the sixth

2.2 大豆蛋白不同加工方式對高脂血癥小鼠降脂的功效

2.2.1 不同干預組對小鼠體重的影響 由表1可知，干預前，各小鼠間的體重無統(tǒng)計學差異，雖然高脂模型組體重高于正常組，但兩組之間仍無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。干預3周，大豆拉絲蛋白組和大豆拉絲蛋白丸子(水煮)組小鼠體重相比高脂模型組顯著降低(P<0.05)。在第5、7周時，大豆拉絲蛋白、大豆拉絲蛋白丸子(油炸)和大豆拉絲蛋白丸子(水煮)組小鼠體重顯著低于高脂模型組(P<0.05)。且隨著干預時間的增長，高脂模型組小鼠體重和其他干預組小鼠體重差異越來越大。

表1 不同膳食干預方式對小鼠體重的影響(±s ，n=10)Table 1 Effects of different diet interventions on mouse body weight (±s , n=10)

表1 不同膳食干預方式對小鼠體重的影響(±s ，n=10)Table 1 Effects of different diet interventions on mouse body weight (±s , n=10)

注：與正常組相比，aa表示P<0.01，a表示P<0.05，與高脂模型組相比，bb表示P<0.01，b表示P<0.05。

組別 干預前(g) 干預1周(g) 干預3周(g) 干預5周(g) 干預7周(g)正常組 46.10±8.19 44.87±9.12 46.50±8.61 46.85±8.40 48.83±8.44高脂模型組 52.95±10.96 54.73±12.61 59.31±12.92a 61.05±14.88a 63.77±16.05a大豆拉絲蛋白組 52.53±10.63 48.26±8.98 46.19±9.07b 45.41±8.65b 43.14±8.60bb大豆拉絲蛋白丸子(油炸)組 52.97±16.74 47.71±14.73 50.06±13.71 44.91±11.35b 44.47±9.89b大豆拉絲蛋白丸子(水煮)組 50.01±12.01 44.95±12.93 45.99±11.35b 43.96±10.43b 43.22±9.14bb

2.2.2 不同干預組對高脂血癥小鼠的肝臟組織的影響 由圖2可知，正常組的肝細胞大小均勻，無明顯的脂肪變性；與正常組相比，高脂模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂，肝細胞核被擠壓移位，細胞之間縫隙寬大，脂滴彌漫浸潤入肝細胞中，病變肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加，并呈現(xiàn)大小不等的空泡變性，部分空泡融合的現(xiàn)象。大部分肝細胞可見明顯脂肪變性，腺泡內(nèi)多見點狀或灶狀壞死；與高脂模型組相比，大豆拉絲蛋白、大豆拉絲蛋白丸子(水煮)細胞間縫隙很小，細胞體積比模型組小，腺泡內(nèi)灶狀壞死不明顯，無明顯的脂質(zhì)空泡以及脂肪滴的形成，病理圖片正常；大豆拉絲蛋白丸子(油炸)組，相比大豆拉絲蛋白及大豆拉絲蛋白(水煮)組仍可見明顯的脂肪滴形成。

圖2 各組小鼠肝臟組織HE染色圖片(200×)Fig.2 Image of staining in liver tissues of mice in each group (200×)

2.2.3 不同干預組對高脂血癥小鼠血脂指標的影響 由圖3可知，干預7周后，與對照組相比，高脂模型組小鼠TC、TG、LDL-C升高，且差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高脂模型組相比，三組大豆拉絲蛋白干預組小鼠血清TC、TG、LDL-C降低，且差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組小鼠HDL-C水平無顯著性變化(P>0.05)。結(jié)果表明，大豆拉絲蛋白具有較好的降低血脂的功效。

圖3 不同干預組對高脂血癥小鼠血脂的影響(±s， n=10)Fig.3 Effect of different intervention groups on liver and epididymal lipid weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

2.2.4 不同干預組對高脂血癥小鼠肝功能ALT、AST的影響 由圖4知，干預7周后，與對照組相比，高脂模型組小鼠血清ALT和AST升高，且差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與高脂模型組相比，三組大豆蛋白干預組小鼠血清ALT和AST降低，且差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)果表明，大豆拉絲蛋白可以改善高脂血癥小鼠的肝功能。

圖4 不同干預組對高脂血癥小鼠肝功能ALT、AST的影響( ，n=10)Fig.4 Effects of different intervention groups on liver function ALT and AST of hyperlipidemia mice (, n=10)

2.2.5 不同干預組對高脂血癥小鼠的肝臟及附睪周脂質(zhì)量及指數(shù)的影響 由圖5可知, 干預7周后，與對照組相比，高脂模型組、大豆拉絲蛋白組和大豆拉絲蛋白(油炸)組小鼠肝臟及肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，高脂模型組小鼠附睪脂肪質(zhì)量和附睪周脂指數(shù)極顯著升高(P<0.01)。與高脂模型組相比，大豆拉絲蛋白(油炸)組小鼠肝臟質(zhì)量降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，大豆拉絲蛋白、大豆拉絲蛋白丸子(油炸)和大豆拉絲蛋白(水煮)組小鼠附睪脂肪質(zhì)量和附睪周脂指數(shù)顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

圖5 不同干預組對高脂血癥小鼠的肝臟及附睪周脂指數(shù)的影響(±s ，n=10)Fig.5 Effects of different intervention groups on liver and periepididymal lipid index of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

3 結(jié)論與討論

植物蛋白具有肝硬化患者的營養(yǎng)支持作用、降低膽固醇水平、減少癌癥的發(fā)生、改善腎臟病和心血管疾病的癥狀等多種生理功能[12]，大豆拉絲蛋白丸子屬于低膽固醇食品。膽固醇與人類的生命健康相關(guān)密切，是維持機體的正常代謝的重要物質(zhì)，也是人體分泌的多種激素必不可少的重要合成原料[13]。我國的丸子類食品消費量巨大，因此研究大豆拉絲蛋白丸子對于改善高脂、高膽固醇飲食方式具有重要的現(xiàn)實意義。本研究中采用大豆拉絲蛋白丸子干預7周后，油炸和非油炸大豆拉絲蛋白丸子均表現(xiàn)了和大豆拉絲蛋白類似的功能，降低了高脂模型小鼠的體重以及血清中TC、TG和LDL的含量，這與Aylin等[14]的結(jié)果類似。Anderson[15]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，每天食用大豆蛋白47 g后，可以降低血清中的TC、TG、LDL。表明大豆蛋白具有良好的降低血脂的功效，特別對于高脂血癥小鼠作用更加明顯。 大豆拉絲蛋白丸子及大豆拉絲蛋白均顯著降低了血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)。ALT、AST可直接反映肝細胞的病理生理狀況，轉(zhuǎn)氨酶水平增高則證明患者肝細胞存在損傷[16-17]。與正常組相比，高脂模型組小鼠的血清ALT和AST升高，小鼠肝細胞出現(xiàn)受損。采用大豆拉絲蛋白干預后，小鼠的ALT和AST指標降低，表明大豆拉絲蛋白丸子可改善肝細胞受損的癥狀。本研究中病理切片顯示，兩組大豆拉絲蛋白丸子均表現(xiàn)與大豆拉絲蛋白類似結(jié)果，肝細胞內(nèi)無明顯的脂質(zhì)空泡形成和炎癥細胞聚集。表明大豆拉絲蛋白丸子在一定程度上改善了高脂飼料造成的脂質(zhì)沉積。小鼠體內(nèi)脂肪沉積減少，進而導致體重降低。這與吳晶等[18]結(jié)果類似，補充大豆蛋白降低了肥胖和超重人群的體重、身體脂肪質(zhì)量、腰圍，具有一定的減肥效果。Howard等[19]也發(fā)現(xiàn)攝入大豆蛋白能夠在女性進入更年期的五年內(nèi)減緩動脈阻塞。

王玉環(huán)等[20]發(fā)現(xiàn)大豆纖維等明顯影響了外裹糊的流變性能，抑制了外裹糊魚塊深度油炸過程的油脂滲透。陸一敏等[21]也發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白復合膜涂膜薯條能夠有效降低吸油率。本研究中，雖然大豆拉絲蛋白丸子采用瞬時油炸的方式來定型，但因大豆纖維可以減少油炸過程中的優(yōu)質(zhì)滲透，因此相比其他油炸食品，營養(yǎng)物質(zhì)破壞較少，產(chǎn)生的有害物質(zhì)也相對較少。吉宏武等[22]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白顯著增加面包蝦的裹粉率，且發(fā)現(xiàn)它能有效降低油炸面包蝦產(chǎn)品的水分損失和吸油量。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)大豆?jié)饪s蛋白(SPC)含天然的抗氧化劑，可降低烹飪造成的誘變活性。由此猜想大豆拉絲蛋白可能由于含有抗氧化劑，即使采用油炸方式烹飪，對大豆拉絲蛋白的降脂功效影響不大。郭玉琴等[24]發(fā)現(xiàn)水煮時間不影響大豆蛋白質(zhì)含量。Matsuoka 等[25]也發(fā)現(xiàn)蛋清食用前是否加熱不影響蛋白質(zhì)利用率。這與本研究中無論是水煮還是油炸對大豆拉絲蛋白的降脂功效無顯著影響結(jié)果類似。這與豆海港等[26]非油炸大豆拉絲蛋白素食比油炸型食品更安全結(jié)果有差異?？赡鼙狙芯恐粡拇蠖估z蛋白的降脂效果分析，結(jié)果比較局限。本研究創(chuàng)新性探討了大豆拉絲蛋白不同加工方式對降脂功效的影響，研究結(jié)果打破了水煮比油炸大豆拉絲蛋白烹飪方式更健康的傳統(tǒng)認知。

綜上所述，本課題組研究的大豆拉絲蛋白丸子可以減輕高脂血癥對機體脂質(zhì)代謝的影響，且油炸和水煮兩種加工方式對降脂功效無明顯影響，為大豆拉絲蛋白產(chǎn)品在食品領(lǐng)域降脂應(yīng)用提供了理論依據(jù)。