王漿酸對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

吳夢(mèng)穎，周 茜，蔡?hào)|偉，韓 雪，牛佳卉，趙 文

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定 071001)

肝臟有促進(jìn)人體生物轉(zhuǎn)化、重要代謝以及解毒的功能，是很多藥物和毒物的靶器官。含有大量的亞硝酸鹽的食物、高脂肪食物、高糖食物、藥物、酒精等的攝入致使肝損傷成為常見(jiàn)病[1-3]。流行病學(xué)調(diào)查表明，急性肝損傷是其重要的臨床表現(xiàn)形式，由于其病理機(jī)制的復(fù)雜性和病情進(jìn)展的迅速性，臨床防治非常困難[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中可用于治療肝損傷的藥物具有療效不確切、不良反應(yīng)多且價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)[6]。目前我國(guó)急性藥物性損傷發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，占爆發(fā)性肝功能衰竭患者的15%～30%。相比于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物，具有護(hù)肝作用的天然產(chǎn)物具有不良反應(yīng)小且價(jià)廉易得的優(yōu)點(diǎn)[7-8]。因此，開(kāi)發(fā)具有輔助、預(yù)防肝損傷作用的功能性食品尤為重要。

王漿酸即反式10-羥基-2-癸烯酸(10-HAD)，是蜂王漿特有的一種具有獨(dú)特生理生物活性的物質(zhì)，是蜂王漿的標(biāo)志物[9-10]。研究表明，王漿酸具有激活人體受損細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制[11-12]，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝[13-15]，清除人體自由基，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞參與免疫反應(yīng)[16-17]，提高機(jī)體的免疫力等功能。但有關(guān)王漿酸對(duì)肝臟的保護(hù)方面的研究報(bào)道甚少。本試驗(yàn)利用刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)誘導(dǎo)建立大鼠急性肝損傷模型，研究王漿酸對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用并探究其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)具有保肝護(hù)肝、對(duì)抗肝損傷的功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠(清潔級(jí)，體重180～220 g) 購(gòu)買于北京華阜康生物科技股份公司，合格證書編號(hào)：SCXK(京) 2015-0004；王漿酸(純度≥99.9%) 石家莊維奧生物科技有限公司；Con A試劑 美國(guó)Sigma公司；聯(lián)苯雙酯滴丸 北京協(xié)和藥廠；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、肝細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、流式專用溶血素FACS LYSING SOLUTION、Rat CD4 PE、Rat CD8A FITC、Rat CD3 APC 美國(guó)Becton Dickinson公司；PBS緩沖液 日本Takara公司及其配方配制；谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、乳糖脫氫酶(lactose dehydrogenase，LDH)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、干擾素γ(tumor necrosis factor γ，INF-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-10(interleukin 10，IL-10)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

FACSCAGBUR-342976型流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司；1500-823型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；組織切片機(jī) 浙江金華華?？平虄x器廠；L530型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將90 只大鼠隨機(jī)分為9 組：陰性對(duì)照組(蒸餾水)、模型對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(150 mg/kg·BW聯(lián)苯雙酯滴丸溶液)、王漿酸低中高劑量組(30、60和120 mg/kg·BW)。每天定時(shí)灌胃一次，連續(xù)30 d。記錄大鼠每周的體重，并且隨時(shí)觀察其生長(zhǎng)情況。末次灌胃2 h后，除陰性對(duì)照組外，其它各組經(jīng)尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)，陰性對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。8 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。

1.2.2 肝臟、脾臟指數(shù)計(jì)算 麻醉結(jié)束后，稱重記錄體重。無(wú)菌條件下，解剖取其肝臟和脾臟，去除脂肪組織，拭干表面，稱重。根據(jù)下式計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，靜置30～60 min，3000 r/min離心10 min，取上清備用。血清AST、ALT、LDH、AKP、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、MDA、SOD、GSH-Px檢測(cè)嚴(yán)格按試劑書操作。

1.2.4 肝臟組織病理切片的制備 肝臟經(jīng)4%多聚甲醛固定，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗凈，石蠟包埋、切片(4～5 μm)、脫蠟、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染液，用中性樹(shù)膠將切片固定在載玻片上[18]。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 大鼠肝臟細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 在光學(xué)顯微鏡下，用PBS緩沖液調(diào)節(jié)每個(gè)流式管中肝臟細(xì)胞濃度至1×106/mL，制成肝細(xì)胞懸液，3000 r/min離心5 min，棄去上清液，控干。加入1 mL wash buffer洗脫液洗脫重懸細(xì)胞，3000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)兩次。用50 μL的DNA標(biāo)記液重懸細(xì)胞。37 ℃水浴60 min，每隔15 min混勻一次。孵育結(jié)束后，加入1 mL Rinse buffer洗脫液洗脫，3000 r/min離心5 min，棄掉上清液。加入0.1 mL FITCBrdU抗體buffer，室溫避光30 min。加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer，室溫避光30 min。3 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析肝細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 大鼠外周血和脾臟T淋巴細(xì)胞亞群 麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，-20 ℃保存?zhèn)溆?。在光學(xué)顯微鏡下，用PBS緩沖液調(diào)節(jié)每個(gè)流式管中肝臟細(xì)胞濃度至1×106/mL，制成脾細(xì)胞懸液。向流氏管中加入100 μL脾細(xì)胞懸液，依次加入CD3-APC 3.5 μL、CD4-PE(藻紅蛋白)3.5 μL、CD8-FITC(異硫氰酸熒光素)2 μL，混勻，避光保存15 min。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液1×FACS Lysing Solution，混勻，避光保存10 min。2500 r/min離心5 min，棄上清液，控干，加入2 mL PBS緩沖液洗滌，2500 r/min離心5 min，棄上清液。樣本加入0.5 mL PBS緩沖液以后，4 ℃避光保存1 h，上機(jī)進(jìn)行FACS檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

肝細(xì)胞凋亡、脾臟及外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)用Cellquest專業(yè)軟件分析，其他數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示。多組間比較采用Oneway-ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠體重和臟器指數(shù)的影響

由表1可知，與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明肝損傷造模成功；低劑量組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高，陽(yáng)性對(duì)照組脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，高劑量組脾臟指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，低、中劑量組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組大鼠肝臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各處理組大鼠脾臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)。

表1 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠體重和臟器指數(shù)的影響(±s ，n=10)Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and organ index of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

表1 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠體重和臟器指數(shù)的影響(±s ，n=10)Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and organ index of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

注：與陰性對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較#P<0.05，##P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較＆P<0.05，＆＆P<0.01；表2同。

組別 劑量(mg/kg·bw) 動(dòng)物(只) 體重(g) 肝臟指數(shù)(mg/g) 脾臟指數(shù)(mg/g)陰性對(duì)照 0 10 295.28±7.03 31.84±3.91 2.17±0.27模型對(duì)照 0 10 289.92±5.92 41.21±34.94** 4.61±1.35**陽(yáng)性對(duì)照 150 10 293.10±8.96 31.72±4.15## 2.82±0.87*##王漿酸低劑量 30 10 292.67±8.68 36.66±2.21*#＆ 2.63±0.85##王漿酸中劑量 60 10 293.63±10.88 34.18±2.80# 2.64±0.72##王漿酸高劑量 120 10 296.79±11.98 32.80±1.94## 2.88±0.63**##

2.2 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝功能的影響

由表2可知，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、LDH和AKP活性均極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明肝損傷造模成功；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組血清ALT、LDH和AKP活性均極顯著降低(P<0.01)，中劑量組LDH活性顯著降低(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，王漿酸中、高劑量組各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，低劑量組LDH活性極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，王漿酸各劑量組可以降低血清中AST、ALT、LDH、AKP的酶活力，其中高劑量組效果與聯(lián)苯雙酯滴丸相當(dāng)。

表2 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷血清中AST、ALT、LDH和AKP的影響(±s ，n=10)Table 2 Effect of royal jelly acid on AST, ALT, LDH and AKP in serum of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

表2 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷血清中AST、ALT、LDH和AKP的影響(±s ，n=10)Table 2 Effect of royal jelly acid on AST, ALT, LDH and AKP in serum of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

組別 劑量(mg/kg·bw) 動(dòng)物(只) AST(U/L) ALT(U/L) LDH(U/L) AKP(U/L)陰性對(duì)照 0 10 20.98±6.81 14.77±3.27 493.26±24.44 172.80±25.24模型對(duì)照 0 10 34.24±8.72** 29.94±7.66** 673.85±23.56** 226.18±26.89**陽(yáng)性對(duì)照 150 10 23.96±6.17## 19.04±4.77*## 532.62±33.31## 154.72±24.75##王漿酸低劑量 30 10 31.42±9.95* 23.61±8.22* 670.80±32.51**＆＆ 194.77±15.16王漿酸中劑量 60 10 26.09±5.08 23.71±4.04** 567.56±38.66# 194.10±26.06王漿酸高劑量 120 10 23.72±4.51## 17.06±7.30## 516.14±31.12## 149.98±26.61##

2.3 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，模型組肝細(xì)胞腫脹，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有細(xì)胞發(fā)生空泡變性。王漿酸低劑量組有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞仍有腫脹；王漿酸中劑量組的炎癥程度明顯輕于模型組；王漿酸高劑量組與中劑量組肝臟的炎癥反應(yīng)與低劑量組類似；陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞有輕度腫脹。

圖1 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷肝臟組織的病理學(xué)影響(HE，400×)Fig.1 Pathological effect of royal jelly acid on liver tissue in rats with acute liver injury induced by Con A (HE, 400×)

2.4 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷肝大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

由圖2可知，與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明模型建立；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸各劑量組大鼠肝細(xì)胞凋亡率均極顯著降低(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，王漿酸高劑量組無(wú)顯著性差異，低、中劑量組極顯著升高(P<0.01)。因此，王漿酸各劑量組均可顯著抑制急性肝損傷大鼠的肝細(xì)胞凋亡，高劑量組效果與聯(lián)苯雙酯滴丸相當(dāng)。

圖2 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷肝細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=10)Fig.2 Effect of royal jelly acid on apoptosis of hepatocytes in rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.5 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠血清細(xì)胞因子的影響

由圖3可知，與陰性對(duì)照組比，模型組大鼠血清中INF-γ、TNF-α、IL-10和IL-6的含量極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明Con A引發(fā)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)；與模型組相比，各處理組大鼠血清中INF-γ、TNF-α、IL-10和IL-6的含量極顯著降低(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，王漿酸各劑量組大鼠血清中IFN-γ含量極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，王漿酸各劑量組均能不同程度的抑制Con A引起的炎癥反應(yīng)，但效果不及聯(lián)苯雙酯。

圖3 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠血清中細(xì)胞因子的影響(±s，n=10)Fig.3 Effect of royal jelly acid on cytokines in serum of rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.6 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

由表3可知，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著性升高(P<0.01)，說(shuō)明Con A影響大鼠肝臟的氧化應(yīng)激。與模型組相比，陽(yáng)性組及各劑量組大鼠血清中MDA含量極顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，王漿酸各劑量組大鼠血清中MDA活性極顯著升高(P<0.01)；王漿酸低、中劑量組SOD，低劑量組GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)。

表3 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力的影響(±s ，n=10)Table 3 Effect of royal jelly acid on antioxidative capacity of liver in rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

表3 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力的影響(±s ，n=10)Table 3 Effect of royal jelly acid on antioxidative capacity of liver in rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

組別 劑量(mg/kg·bw) 動(dòng)物(只) MDA(nmol/mg Pro) SOD(U/mg Pro) GSH-Px(U/mg Pro)陰性對(duì)照 0 10 6.33±0.50 443.74±17.02 527.52±55.41模型對(duì)照 0 10 10.65±0.58** 285.13±19.47** 374.12±67.84**陽(yáng)性對(duì)照 150 10 4.65±0.42**## 442.21±9.91## 485.74±76.33**##王漿酸低劑量 30 10 8.11±0.53**##＆＆ 361.54±13.15**##＆＆ 437.47±58.94**##＆＆王漿酸中劑量 60 10 8.35±0.55**##＆＆ 373.30±15.52**##＆＆ 451.97±47.00**##＆＆王漿酸高劑量 120 10 7.67±0.40**##＆＆ 427.75±11.19*##＆＆ 457.78±50.66**##＆＆

2.7 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝細(xì)胞周期的影響

由圖4可知，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠處于G1期的細(xì)胞數(shù)極顯著降低、G2期的細(xì)胞數(shù)極顯著升高(P<0.01)，處于S期的細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸高劑量組大鼠處于G1期的細(xì)胞數(shù)極顯著升高(P<0.01)，王漿酸低、中劑量組大鼠處于G1期的細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠處于S期的細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸各劑量組處于G2期的細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，王漿酸各劑量組無(wú)顯著性差異。

圖4 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝細(xì)胞周期的影響(±s，n=10)Fig.4 Effect of royal jelly acid on the hepatocyte cycle of rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.8 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

由圖5可知，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠外周血中的CD3+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的量顯著降低(P<0.05)，CD3+CD4+的量極顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸各劑量組極顯著提高CD3+CD4+的含量(P<0.01)，顯著提高CD3+、CD3+CD8+的含量(P<0.05)；與模型組比較，王漿酸中、高劑量組大鼠外周血中CD4+/CD8+極顯著升高(P<0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸低劑量組大鼠外周血中CD4+/CD8+顯著升高(P<0.05)。王漿酸各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異。

圖5 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)及比例的影響(±s，n=10)Fig.5 Effect of royal jelly acid on the percentage and proportion of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.9 王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響

由圖6可知，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的百分含量極顯 著 降 低(P<0.01)，CD4+/CD8+極 顯 著 升 高(P<0.01)，說(shuō)明Con A的攝入會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力的下降；王漿酸各劑量組大鼠脾臟中的CD3+的百分含量顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸各劑量組均能極顯著提高大鼠脾臟中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的百分含量(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和王漿酸低劑量組大鼠脾臟CD4+/CD8+極顯著降低(P<0.01)，王漿酸中劑量組大鼠脾臟CD4+/CD8+顯著升高(P<0.05)。王漿酸各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)Con A對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性損害時(shí)，會(huì)增加肝細(xì)胞膜的通透性，血液中AST、ALT、LDH、AKP等酶的濃度會(huì)隨著Con A攝入的增加而增多。當(dāng)血液中AST和ALT的活力異常升高時(shí)，說(shuō)明肝臟組織已經(jīng)到了急性損傷的病理期。此時(shí)肝小葉內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象并且會(huì)伴隨肝細(xì)胞的大量壞死和凋亡[19-20]。

當(dāng)機(jī)體受到Con A的刺激，肝臟進(jìn)入急性損傷的病理期時(shí)，肝小葉內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并伴隨肝細(xì)胞的大量凋亡[21-22]。Con A進(jìn)入血液以后會(huì)與中性粒細(xì)胞以共價(jià)鍵的形式相結(jié)合，最終導(dǎo)致肝臟細(xì)胞受到其結(jié)合產(chǎn)物的浸潤(rùn)[23]。同時(shí)還伴隨著誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子以及血小板激活因子等，從而引起肝細(xì)胞損傷/凋亡。

機(jī)體內(nèi)肝竇與Con A會(huì)發(fā)生特異性的結(jié)合，使得T淋巴細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，對(duì)肝臟起到一定的損傷的作用。研究表明，當(dāng)肝臟發(fā)生急性損傷時(shí)，肝小葉內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。TNF-α、IL-6和INF-γ等在引發(fā)急性肝損傷的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，大鼠被提前腹腔注射抗TNF-α、IL-6、INF-γ的單抗，機(jī)體能夠很好地預(yù)防肝損傷的發(fā)生[24]。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)炎癥因子如TNF-α、INF-γ、IL-6的升高。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

當(dāng)機(jī)體肝臟細(xì)胞受到破壞的時(shí)候，自由基大大增加，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體消耗大量的SOD來(lái)消除機(jī)體內(nèi)的自由基，以此來(lái)對(duì)肝損傷進(jìn)行自我修復(fù)，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)SOD減少。細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)镸DA的大量存在而受到損害，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，間接反映細(xì)胞損傷的程度[25]。當(dāng)用Con A對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行損傷的時(shí)候，機(jī)體會(huì)以產(chǎn)生大量MDA的形式來(lái)對(duì)機(jī)體組織進(jìn)行破壞，同時(shí)機(jī)體會(huì)自身的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)對(duì)受損細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，GSH-Px是這個(gè)過(guò)程的主要修復(fù)工具。本研究表明，王漿酸各劑量組能通過(guò)調(diào)節(jié)MDA、SOD、GSH-Px的含量來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，從而達(dá)到對(duì)抗肝損傷的目的。

本細(xì)胞周期試驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比較，模型組G1期的細(xì)胞百分比顯著下降，S期細(xì)胞百分比差異不顯著，說(shuō)明機(jī)體的肝細(xì)胞進(jìn)行了一系列的增殖，Con A促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行分化。Con A會(huì)刺激細(xì)胞由原來(lái)的靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為活躍態(tài)，從而進(jìn)入分裂期，進(jìn)行細(xì)胞增殖，然而王漿酸劑量組可以很好地抑制Con A誘導(dǎo)肝損傷大鼠的肝細(xì)胞增殖，從而使機(jī)體恢復(fù)正常免疫活性以達(dá)到護(hù)肝的作用。

為了進(jìn)一步闡明王漿酸是如何的發(fā)揮護(hù)肝作用，本研究還檢測(cè)了脾臟及外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)水平以及肝細(xì)胞細(xì)胞周期的變化。CD3+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫能力的標(biāo)志。CD4+/CD8+反映機(jī)體免疫能力平衡狀況[26]。以CD4+T淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)是Con A造成的肝損傷的主要形式。CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞可發(fā)展成功能不同的Th1和Th2亞群。Con A造成急性肝損傷，會(huì)使CD4+發(fā)展成Th1亞群，而Th1會(huì)分泌大量的IFN-γ，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。模型組大鼠脾臟及外周血中的CD3+比陰性對(duì)照組低，原因是足劑量的Con A誘導(dǎo)使脾臟中CD3+T細(xì)胞的數(shù)量以及活化程度均受到了抑制，造成機(jī)體的免疫功能下降；CD8+細(xì)胞比例顯著降低，可能與造成免疫損傷過(guò)程中導(dǎo)致淋巴細(xì)胞消耗較多或與向肝臟內(nèi)大量浸潤(rùn)有關(guān)[27]。本研究表明，王漿酸各劑量組能顯著提高CD3+的含量，說(shuō)明王漿酸各劑量組可以提高機(jī)體的免疫力；并且可以穩(wěn)定外周血中CD4+/CD8+的比例，以此來(lái)穩(wěn)定機(jī)體的免疫功能。

Con A誘發(fā)了大鼠急性肝臟損傷模型是以T淋巴細(xì)胞為介導(dǎo)的肝臟損傷為特征，能夠較好的模擬人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病的肝損傷過(guò)程。Con A作為一種植物凝集素可促進(jìn)T細(xì)胞分裂和巨噬細(xì)胞激活，促進(jìn)TNF-α以及干擾素類的釋放，從而導(dǎo)致線粒體代謝障礙，發(fā)生細(xì)胞凋亡。王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和脾臟腫大有一定的改善作用，而且可以降低血清中ALT、AST、LDH和AKP酶活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力；恢復(fù)脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比例，加強(qiáng)機(jī)體免疫力；通過(guò)減少機(jī)體MDA的合成，增加SOD、GSH-Px的合成來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力；并且可以抑制細(xì)胞分裂。同時(shí)各劑量組肝細(xì)胞凋亡及肝細(xì)胞炎性損傷情況均有明顯改善。但王漿酸對(duì)Con A誘導(dǎo)的特異性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制的具體機(jī)理需要進(jìn)一步闡明，王漿酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的通路需進(jìn)一步研究。以上結(jié)果說(shuō)明王漿酸具有護(hù)肝作用，為其功能性食品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。