UPLC-Q-Orbitrap HRMS測定白酒接觸塑料制品中21種雙酚類及其衍生物

劉 松，趙振宇，曾穩(wěn)穩(wěn)，聶 葉，王和玉

(貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501)

雙酚類化合物及其衍生物(Bisphenols，BPs)是一類結(jié)構(gòu)相似(具有兩個羥苯基)的物質(zhì)，主要包括雙酚A(Bisphenol A，BPA)、雙酚S(Bisphenol S，BPS)、雙酚A二縮水甘油醚(Bisphenlo A-diglycidyl，BADGE)、雙酚F二縮水甘油醚(BFDGE)和四氯雙酚A(Tetrachlorobisphenol A，TCBPA)等[1-2]。它們?？勺鳛榄h(huán)氧酚醛內(nèi)涂料、聚氯乙烯有機溶膠內(nèi)涂料等食品接觸塑料材料的初始原料、熱穩(wěn)定劑和增強劑[3]。由于BPA具有內(nèi)分泌干擾性、擬雌激素活性和致癌效應(yīng)[4-6]，國內(nèi)外出臺了一系列的控制法規(guī)，歐盟、美國等率先對食品接觸材料中BPA的遷移進(jìn)行了嚴(yán)格限制[7-8]，國家標(biāo)準(zhǔn)GB9685-2016規(guī)定BPA的遷移限量為0.6 mg/kg[9]。雖然一些與BPA結(jié)構(gòu)和性能相似的BPS、BPF、BFDGE等逐漸代替了BPA在實際生產(chǎn)中使用，但已有研究證明，該類雙酚類物質(zhì)同樣存在潛在危害，并且更易富集，在環(huán)境中不易降解[10-11]。在白酒生產(chǎn)過程中，輸酒管道密封墊和瓶蓋等物資常采用塑料制品，白酒與之接觸過程中，就可能將塑料制品中的雙酚類及其衍生物帶入酒中，產(chǎn)生食品安全風(fēng)險問題。因此，開發(fā)白酒接觸塑料中雙酚類及其衍生物化合物的檢測方法對防范白酒的食品安全事件的發(fā)生具有重要的意義。

目前，測定雙酚類及其衍生物化合物的方法主要有液相色譜法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-16]、氣相色譜法[17]、氣相色譜-質(zhì)譜法[18]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[19]、毛細(xì)管電泳法[20]、生物傳感器法[21]等。雙酚類及其衍生物化合物含有酚羥基，屬于中等極性，沸點較高，適合HPLC分析[22]，但HPLC法靈敏度較低，僅依據(jù)保留時間定性，可能出現(xiàn)假陽性[23-24]；液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度高、選擇性好、抗干擾能力強，是目前該類化合物最常用的檢測方法[1]。但關(guān)于酒類產(chǎn)品中雙酚類及其衍生物的檢測方法鮮有報道，白酒在生產(chǎn)過程中接觸到塑料制品的種類較多，導(dǎo)致可能遷移進(jìn)入白酒中雙酚類及其衍生物化合物的種類較多。因而需要建立一種覆蓋范圍廣的多種雙酚類及其衍生物化合物的快速測定方法，完善白酒產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)称钒踩芯?，保障白酒的食品安全?/p>

本研究利用超高效液相色譜/四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Q/Orbitrap HRMS)快速篩查測定白酒接觸塑料中21種雙酚類及其衍生物，以建立一種種類覆蓋范圍廣、快速、準(zhǔn)確的同時測定方法，降低假陽性檢出率，為白酒接觸塑料制品中雙酚類及其衍生物的定性、定量分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白酒接觸塑料制品 貴州茅臺提供；雙酚A(BPA)、雙酚B(BPB)、雙酚C(BPC)、雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)、雙酚Z(BPZ)、雙酚AF(BPAF)、雙酚AP(BPAP)、雙酚P(BPP)、4,4-磺酰 二(2-甲 基 苯 酚)(DMBPS)、四 氯 雙 酚A(Tetrachlorobisphenol A，TCBPA)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)、雙酚A二縮水甘油醚(Bisphenlo A-diglycidyl，BADGE)、雙酚A-(2-3-二羥基丙基)甘油醚(BADGE-H2O)、雙酚A-(2-3-二羥基丙基)醚(BADGE-2H2O)、雙酚A-(3-氯-2羥丙基)甘油醚(BADGE-HCl)、雙酚A-(3-氯-2羥丙基)醚(BADGE-2HCl)、雙酚A-(3-氯-2羥丙基)(2-3-二羥基丙基)醚(BADGE-H2O-HCl)、雙酚F二縮水甘油醚(BFDGE)、雙酚F-(2-3-二羥基丙基醚)(BFDGE-2H2O)、雙酚F-(3-氯-2羥丙基)醚(BFDGE-2HCl)21種雙酚類及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇 LCMS級，默克公司；無水乙醇 HPLC級，美國天地公司；0.22 μm微孔濾膜 Agilent公司。

Q-Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 Thermo公司；XP205電子天平 梅特勒公司；MILLI-Q純水儀 密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 遷移試驗：參照GB 5009.156-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗預(yù)處理方法通則》選擇遷移量測定要求和結(jié)果表述要求，按照GB 31604.1-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》，選擇合理的食品模擬液和遷移條件，最終遷移試驗食品模擬液采用體積分?jǐn)?shù)50%和95%的乙醇水溶液。

遷移液的處理：采用甲醇稀釋10倍，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的可以進(jìn)一步用甲醇稀釋，過0.22 μm的濾膜后分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取21種雙酚類及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g用甲醇溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶中，振蕩均勻即得濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，存于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取空白白酒接觸塑料樣品，按照1.2.1項處理，得到空白白酒接觸材料基質(zhì)提取液，分別取21種雙酚類及其衍生物儲備液，空白白酒接觸材料基質(zhì)提取液稀釋，得到21種雙酚類及其衍生物濃度依次為2.5、5、10、25、50、100、250、500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 儀器條件 色譜條件：色譜柱：Eclipse XDBC18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速：300 μL/min；流動相：A為5 mmol/L的乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，30%B，2～8 min，60%B，8～13 min，90%B，13～17 min，90%B，17～18 min，30%B，18～20 min，30%B，整個分析流程共20 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用加熱HESI源，毛細(xì)管電壓：± 3.7 kV；毛細(xì)管溫度：200 ℃；鞘氣：40 Arb(1 Arb ≈0.3 L/min)；輔助氣：15 Arb；吹掃氣：0 Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；Full MS/ddMS2掃描模式；掃描范圍：150～600 m/z，正負(fù)離子同時采集；一級質(zhì)譜分辨率為70000，二級質(zhì)譜分辨率為17500；歸一化碰撞能量(NCE)30、45和60 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器自帶數(shù)據(jù)分析軟件Xcalibur 4.2開展數(shù)據(jù)采集和質(zhì)譜圖分析工作，Mass Frontier 7.0軟件開展裂解規(guī)律研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 遷移液前處理方法優(yōu)化

遷移液中乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，塑料加工助劑和相關(guān)化合物含量較多，基質(zhì)效應(yīng)較大，樣品前處理方面，為避免樣品前處理過程中帶來外來污染物，利用儀器高靈敏度和分辨率的特性，采用甲醇稀釋的方式降低基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如圖1所示，而當(dāng)稀釋倍數(shù)為5倍、2倍時，BPA回收率隨著目標(biāo)物濃度的增加而變大，2倍時回收率可達(dá)到349.6%，當(dāng)10倍時，遷移液基質(zhì)對21種目標(biāo)物的影響較小，具有較好的回收率。

圖1 不同稀釋倍數(shù)對BPA回收率影響Fig.1 Effects of different dilution times on the recovery of BPA

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將濃度為500 μg/L的雙酚類及其衍生物化合物單一標(biāo)準(zhǔn)工作液通過蠕動泵，8 μL/min流速直接注入質(zhì)譜進(jìn)行全掃描分析，在正離子/負(fù)離子模式下，依據(jù)目標(biāo)物的理論精確質(zhì)量數(shù)，找到目標(biāo)物的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M-H]-等，12種雙酚類化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較正離子模式高，宜采用負(fù)離子掃描模式。負(fù)離子模式下，雙酚類化合物的酚羥基中失去一個H，形成[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，精確質(zhì)量數(shù)見表1。9種雙酚類衍生物負(fù)離子模式下響應(yīng)較正離子模式低，宜采用正離子掃描模式，[M+NH4]+峰響應(yīng)強度大于[M+H]+峰，所以選擇準(zhǔn)分子離子峰為[M + NH4]+峰，精確質(zhì)量數(shù)見表1。以目標(biāo)物準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)為依據(jù)，采用Full MS/ddMS2掃描模式，優(yōu)化碰撞能量，優(yōu)化目標(biāo)物的定性離子豐度，采用歸一化碰撞能量(NCE)30、45和60 eV時，目標(biāo)物定性離子豐度高，定性離子信息見表1，在數(shù)據(jù)處理過程中，依據(jù)高分辨質(zhì)譜特性，定量離子為一級質(zhì)譜母離子，子離子為定性離子。雙酚類化合物在裂解過程中，形成[M -O - H]-的定性離子和兩苯環(huán)中間C連接處發(fā)生斷裂形成定性離子，以BPA為例，得到主要離子碎片為：[M-H-O]-m/z 211.0769和[M-H-C6H6O]-m/z 133.0647。雙酚類衍生物在裂解過程中，易形成兩苯環(huán)中間C連接處發(fā)生斷裂形成定性離子，以BADGE為例，得到主要離子碎片為：m/z 135.0809和m/z 191.1074，裂解路徑見圖2。

表1 21種目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)、電離模式、保留時間、定性離子Table 1 Exact mass number, ionization mode, retention time and qualitative ions of 21 target species

圖2 BADGE裂解圖Fig.2 Mass fragment of BADGE

2.3 色譜條件優(yōu)化

雙酚類及其衍生物化合物屬于中等極性化合物，可采用C18柱進(jìn)行色譜分離。比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液3種流動相對目標(biāo)化合物離子化程度的影響。結(jié)果顯示，甲醇-水溶液體系時雙酚類衍生物化合物的峰型及靈敏度優(yōu)于乙腈-水體系，可能是甲醇為質(zhì)子給體溶劑，有利于雙酚類衍生物化合物電離成正離子[25]，同時發(fā)現(xiàn)，在甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液體系中，由于銨離子的存在，有助于消除鈉離子的干擾，更有利于雙酚類衍生物化合物形成[M+NH4]+離子，同張海婧[26]、張朝暉等[27]結(jié)論相似。本文選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，C18色譜柱分離21種雙酚類及其衍生物化合物，目標(biāo)物峰型較好，響應(yīng)較高，滿足目標(biāo)物的分析要求，以目標(biāo)物的準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖見圖3。

圖3 21種雙酚及雙酚衍生物提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion current chromatograms of 21 bisphenol and bisphenol diglycidyl ethers

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限 對21種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度在2.5～500.0 μg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以目標(biāo)組分的峰面積y對相應(yīng)質(zhì)量濃度x(μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)均大于0.9965。以信噪比(S/N)為3作為儀器方法的檢出限(LOD)，S/N為10作為儀器方法的定量限(LOQ)，根據(jù)樣品前處理過程，計算方法的定量限，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限和方法定量限，結(jié)果見表2，儀器檢出限在0.18～1.09 μg/L之間，方法定量限在6.0～36.3 μg/L之間。

表2 21種目標(biāo)物的線性關(guān)系、儀器檢出限和方法定量限Table 2 Linear range, calibration curve, R2, LOD and LOQ of 21 compounds

2.4.2 加標(biāo)回收率 對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實驗，分別添加3個不同質(zhì)量濃度的目標(biāo)分析物，每個添加水平6個平行實驗，計算平均加標(biāo)回收率和精密度(以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD計)，結(jié)果見表3。目標(biāo)分析物的回收率為82.3%～106.4%，RSD為0.7%～5.2%。

表3 21種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 21 compounds（n=6）

續(xù)表 3

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)評價 液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法中，目標(biāo)物的電離受溶劑環(huán)境、離子源結(jié)構(gòu)和其他物質(zhì)的影響較大，盡管遷移液樣品基質(zhì)較為簡單并做了稀釋處理，但在研究中仍發(fā)現(xiàn)遷移液中基質(zhì)對目標(biāo)物的測定有影響[28]，例如回收率和穩(wěn)定性等，因此在21種目標(biāo)物的測定方法中開展基質(zhì)效應(yīng)研究是有必要的，本實驗采用外標(biāo)法定量，基質(zhì)效應(yīng)(ME)采用空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(Slopea)與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(Slopeb)之比進(jìn)行評價，即ME=(Slopea/Slopeb)×100。ME>100%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強作用，ME<100%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制作用，當(dāng)ME為80%～120%時表示輕微的基質(zhì)效應(yīng)，50%～80%或120%～150%時表示中等基質(zhì)效應(yīng)，<50%或>150%時標(biāo)示較強基質(zhì)效應(yīng)[29]。本實驗采用3種塑料材料(PTFE密封墊圈、ABS、PTFE、HDPE、PS、AS、PVC、LDPE復(fù)合材質(zhì)的整個瓶蓋、HDPE過濾板)樣品考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明，在三種材料中，21種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)為78.3%～135.4%，無較強的基質(zhì)效應(yīng)，其中TCBPA在復(fù)合材質(zhì)的整個瓶蓋中ME為78.3%，表現(xiàn)為中等抑制基質(zhì)效應(yīng)，BPF在復(fù)合材質(zhì)的整個瓶蓋中ME為135.4%，表現(xiàn)

為中等增強基質(zhì)效應(yīng)，其它化合物在三種材料中ME在80%～120%之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。本方法可以采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線對各目標(biāo)物進(jìn)行定量。

2.5 實際樣品的測定

采用本方法測定了白酒生產(chǎn)過程中可能接觸的ABS、PTFE、HDPE、PS、AS、PVC、LDPE等材質(zhì)瓶蓋組件、墊圈和過濾板等15種物資，未有樣品檢出含有這21種雙酚類及其衍生物，結(jié)果詳情見表4。

表4 樣品的測定結(jié)果Table 4 Results of samples

3 結(jié)論

本實驗建立了超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測定白酒接觸塑料中21種雙酚類及其衍生物含量的方法。該方法較已有方法覆蓋范圍廣，測定種類測定效率高，假陽性低，21種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度在2.5～500.0 μg/L之間線性關(guān)系良好，R2均大于0.9965，方法定量限在6.0～36.3 μg/L之間，加標(biāo)回收率為82.3%～106.4%，RSD為0.7%～5.2%。該方法準(zhǔn)確快速，靈敏度高，應(yīng)用于實際樣品檢測時重復(fù)性良好，可為白酒生產(chǎn)過程中此類化合物的風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支撐，對完善白酒產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)称钒踩芯烤哂兄匾饬x。