靜樂黑枸杞花青素的純化及其抗氧化特性

原紅霞，侯倩宜，杜 姍，田 歡，李青山,

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院, 山西晉中 030619；2.基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西晉中 030619)

花青素，又稱花色素，是存在于自然界深色植物中的一類水溶性黃酮類化合物，具有抗衰老、保護(hù)心血管、抗炎、抗氧化、預(yù)防癌癥等藥理作用[1]。茄科枸杞屬多棘刺灌木黑枸杞，含有較豐富的花青素?，F(xiàn)代藥理研究表明，黑枸杞花青素具有降糖、降脂、保護(hù)神經(jīng)、提高記憶力、抗炎、抗氧化、防輻射、治療腸炎、治療非酒精性脂肪肝炎等作用[2-8]。因此，黑枸杞花青素的開發(fā)具有較大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

大孔吸附樹脂具有化學(xué)穩(wěn)定、吸附容量大、選擇性良好、操作條件簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于花青素、多酚、黃酮等天然活性化合物的分離和純化[9-11]。趙文娟等[12]采用D101樹脂對黑果枸杞(新疆產(chǎn))的原花青素進(jìn)行了分離純化，純化后樣品含量增加了2.17倍；呂玉姣等[13]采用HP-2MGL型樹脂對黑果枸杞(新疆產(chǎn))的花青素進(jìn)行了分離純化，純化后樣品含量增加了3.07倍；顧子揚(yáng)等[14]采用Amberlite XAD-7HP型樹脂對黑枸杞(青海產(chǎn))的花青素進(jìn)行了分離純化，純化后樣品峰面積均明顯增加，但未見對2012年山西靜樂縣引進(jìn)試種的黑枸杞[15]中的花青素的研究報(bào)道。因此，本文以靜樂黑枸杞[16]為研究對象，考察國產(chǎn)5種大孔吸附樹脂(型號分別為HPD100、D101、NKA、AB-8、HPD400)對黑枸杞花青素的吸附和解析性能，篩選最佳樹脂，并確定最佳分離純化工藝，同時(shí)測定粗提物和純化產(chǎn)物對DPPH·、·OH和ABTS+·的清除能力，以期為山西靜樂縣黑枸杞的進(jìn)一步開發(fā)加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞的成熟干燥果實(shí) 山西靜樂縣，粉碎，過40目篩；HPD100大孔樹脂 東鴻化工有限公司；D101、NKA大孔樹脂 陜西樂博生化科技有限公司；AB-8、HPD400大孔樹脂 陜西樂博生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 東京化成工業(yè)株式會社；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法) 碧云天生物科技有限公司；水 蒸餾水；其余試劑 均為分析純。

RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Ph-610型pH計(jì) Wiggens公司；ZXY-48型氣浴恒溫振蕩器 常州潤華電器有限公司；6100S型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Scientz-N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑枸杞花青素的提取 稱取靜樂黑枸杞粉末適量，精密稱定，加入50%乙醇(10倍量)，45 ℃超聲0.5 h，過濾，取上清液，重復(fù)兩次，合并三次提取的上清液，減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥，置于4 ℃冰箱保存，備用。臨用前加適量水全部溶解得黑枸杞粗提液。

1.2.2 黑枸杞花青素得率的測定 采用pH示差法[17]，按下式計(jì)算花青素濃度：

式中：A-吸光度；λ-最大吸收波長；DF-稀釋倍數(shù)；ε-矢車菊花青素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900；MW(分子量)，449.2。

1.2.3 黑枸杞花青素的純化

1.2.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理 無水乙醇浸泡大孔樹脂 24 h 后，無水乙醇反復(fù)洗滌至乙醇液與等體積的水混合不產(chǎn)生白色渾濁時(shí)，用水洗至無醇味；再5%NaOH浸泡大孔樹脂12 h后，水洗至中性；最后用5%HCL浸泡大孔樹脂12 h后，水洗至中性，備用[11-12]。

1.2.3.2 最佳樹脂的篩選 a. 靜態(tài)吸附試驗(yàn)：稱取已處理好的 HPD100、D101、NKA、AB-8、HPD400 型樹脂各3.00 g，各加入30 mL黑枸杞花青素提取液(含生藥0.1 mg/mL)，置氣浴恒溫振蕩器(25 ℃，120 r/min)中振蕩吸附24 h，采用pH示差法測定原液和吸附液中黑枸杞花青素的含量，計(jì)算公式如下：

吸附率(%)=(C0-C1)/C0×100

吸附量(mg/g)=(C0-C1)×V/m

式中：C0和C1分別為原液和吸附后溶液中花青素的濃度(mg/ mL)；V：加入體積(mL)；m：樹脂量(g)。

b. 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)：稱取5種型號的大孔樹脂各5.00 g，濕法裝柱(柱徑×柱長：2.0 cm×30.0 cm)，分別將50 mL黑枸杞提取液(含生藥0.1 mg/mL)以相同流速4 BV(bed volume，柱床體積，7 mL)/h通過各型號樹脂，采用pH示差法測定吸附液中花青素的濃度，計(jì)算樹脂的吸附量，計(jì)算同靜態(tài)吸附法。將上述已吸附的大孔樹脂先用4 BV的純化水水洗除雜，再用4 BV的75%乙醇洗脫，采用pH示差法測定解析液中花青素的含量，解吸率計(jì)算如下：

吸附量(mg/g)=(m0-m1)/m

吸附率(%)=(m0-m1)/m0×100

解吸率(%)=m2/(m0-m1)×100

式中，m0、m1和m2分別為原液、吸附液、解吸液中花青素的質(zhì)量(mg)；m為樹脂的質(zhì)量(g)。

1.2.3.3 樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn) a. 上樣質(zhì)量濃度的確定：將50 mL不同濃度的黑枸杞提取液(含生藥0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 g/mL)以相同流速(4 BV/h)通過樹脂柱，動(dòng)態(tài)吸附后，采用pH示差法測定吸附液中花青素的濃度，計(jì)算其吸附率。

b. 上樣體積的確定：將黑枸杞提取液(0.2 g/mL)以4 BV/h的流速注入樹脂柱中，同時(shí)收集吸附液(7 mL/管)。采用pH示差法測定吸附液中花青素的濃度，繪制泄露曲線，確定最佳的上樣體積。

c. 解析液濃度的確定：將49 mL黑枸杞提取液(濃度為0.2 g/mL)，加入樹脂柱中，以4 BV/h的流速進(jìn)行吸附，采用pH示差法測定吸附液中花青素的濃度，計(jì)算吸附率。分別用濃度為30%、45%、60%、75%和90%的乙醇溶液以4 BV/h的流速洗脫，收集解析液，采用pH示差法測定解析液中花青素的濃度，計(jì)算解吸率。

d. 洗脫劑用量的確定：將49 mL黑枸杞提取液(濃度為0.2 g/mL)，加入樹脂柱中，以4 BV/h的流速進(jìn)行吸附，再用75%乙醇洗脫，洗脫速度為4 BV/h，采用pH示差法測定解析液中花青素的濃度，繪制洗脫曲線。

1.2.4 黑枸杞花青素體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH·清除能力測定 取2 mL的DPPH溶液(濃度約為0.05 mg/mL)，加入等量的黑枸杞粗提液或純化液，混勻，暗處反應(yīng)0.5 h，于分光光度計(jì)515 nm處測量，測得值為As，控制樣本用2 mL無水乙醇代替提取物，測得值為A0。黑枸杞粗提液或純化液對DPPH·的清除率[18]S(%)=(A0-As)/A0×100，并計(jì)算IC50值。

1.2.4.2 ·OH清除能力測定 精密吸取PBS溶液2.0 mL，鄰二氮菲溶液(7.5 mmol/L)0.2 mL，硫酸亞鐵溶液(7.5 mmol/L)0.2 mL，樣品液0.4 mL，雙氧水溶液(1%)0.4 mL，水 3.8 mL，配置好后37 ℃水浴加熱1 h，于分光光度計(jì)510 nm處測定，測得值為A樣；以水代替雙氧水和樣品測得值為A空；以水代替樣品液測得值為A損。黑枸杞粗提液或純化液對·OH的清除率[19]S(%)=(A樣-A損)/(A空-A損)× 100，并計(jì)算IC50值。

1.2.4.3 ABTS+·清除能力的測定 在96孔板中，每孔加入ABTS工作液200 μL，黑枸杞粗提液或純化液10 μL，混勻，靜置5 min(避光)，734 nm處測定吸光度值OD樣品，以空白溶劑代替樣品液測得值為OD0。黑枸杞提取物對ABTS+·的清除率[20-21]S(%)=(OD0-OD樣品)/OD0×100%，并計(jì)算IC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳樹脂的篩選試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 大孔樹脂對黑枸杞花青素的靜態(tài)吸附效果 由圖1可知，五種大孔樹脂對黑枸杞花青素的靜態(tài)吸附量和吸附率的的差別不明顯，都可作為篩選對象。

圖1 不同樹脂對黑枸杞花青素的靜態(tài)吸附結(jié)果Fig.1 Results of static adsorption of Lycium ruthenicum anthocyanins by different resins

2.1.2 大孔樹脂對黑枸杞花青素的動(dòng)態(tài)吸附與解吸效果 由圖2可知，五種樹脂對于黑枸杞花青素的吸附率基本一致，無顯著性差異，除AB-8的解析率偏低外，其余四種樹脂解析率基本一致，無顯著性差異(P>0.05)，因此，除AB-8的其余四種樹脂均可作為篩選對象，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，本次實(shí)驗(yàn)選用樹脂HPD100。

圖2 不同樹脂對黑枸杞花青素的動(dòng)態(tài)吸附和解析結(jié)果Fig.2 Results of dynamic adsorption and desorption of Lycium ruthenicum anthocyanins by different resins

2.1.3 樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3.1 上樣質(zhì)量濃度對吸附率的影響 由圖3可知，黑枸杞生藥濃度由0.025 g/mL增加至0.2 g/mL時(shí)，其吸附率逐漸增加且趨于平緩，其原因可能是濃度增加有利于花青素分子與樹脂的接觸面積；但濃度大于0.2 mg/mL時(shí)，吸附率反而降低，其原因可能是濃度過高時(shí)溶液中雜質(zhì)含量增多，增加了雜質(zhì)與花青素對樹脂的競爭，吸附率下降。因此，最好選擇濃度0.2 g/mL作為HPD100樹脂純化黑枸杞花青素時(shí)的初始上樣濃度。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對吸附率的影響Fig.3 Effects of sample concentration on adsorption rate

2.1.3.2 上樣體積對樹脂吸附性能的影響 由圖4可知，隨上樣量增加，流出液中黑枸杞花青素濃度增加，即HPD100樹脂對花青素的吸附效果隨上樣量的增加而下降。達(dá)到7 BV時(shí)，花青素出現(xiàn)明顯泄漏，泄露總量為上樣量5%時(shí)，認(rèn)為已經(jīng)出現(xiàn)泄露，此時(shí)花青素與樹脂的結(jié)合基本達(dá)到飽和，因此確定上樣體積為7 BV，相當(dāng)于49 mL。

圖4 上樣體積對吸附性能的影響Fig.4 Effects of sample volume on adsorption capacity

2.1.3.3 乙醇濃度對樹脂解析效果的影響 由圖5可知，隨著乙醇濃度增大(30%～75%)，解吸率也隨之增加，當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)，解吸率達(dá)到最高92.3%，而乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)，洗脫能力反而減弱，根據(jù)相似相溶的原理，可知75%乙醇有利于花青素的解吸附，乙醇濃度過低或過高時(shí)，可能會影響花青素和大孔樹脂之間的相互作用，故選用75%乙醇作為洗脫溶劑。

圖5 乙醇濃度對解吸率的影響Fig.5 Effects of ethanol fraction on desorption rate

2.1.3.4 洗脫溶劑(75%乙醇)用量對樹脂吸附性能的影響 由圖6可知，隨著洗脫溶劑用量的增加，洗脫劑中花青素的濃度呈先增加后降低的趨勢；當(dāng)洗脫劑用量為6 BV時(shí)，黑枸杞花青素基本被洗脫，繼續(xù)增加洗脫劑用量，仍有花青素洗脫下來，但濃度很低。從成本方面考慮，選用6 BV的洗脫劑用量。

圖6 溶劑用量對吸附性能的影響Fig.6 Effects of elution amount on adsorption capacity

將處理好的HPD100樹脂濕法裝柱，按上述最優(yōu)條件，對黑枸杞粗提液進(jìn)行分離純化，純化液濃縮后冷凍干燥，備用。采用pH示差法測定花青素的含量，結(jié)果表明，黑枸杞粗提物中花青素的純度為2.38%，純化后黑枸杞花青素純度為17.82%，由此可知，經(jīng)HPD100樹脂純化后，花青素的純度提高至原來的7.49倍，說明此方法純化效果良好。

2.2 純化對黑枸杞花青素抗氧化活性的影響

2.2.1 DPPH·清除能力 脂溶性DPPH·是一種穩(wěn)定的以N為中心的自由基，其清除能力可以用來表征物質(zhì)的抗氧化能力[22-23]。物質(zhì)對DPPH·的清除率越高，表明其抗氧化能力越強(qiáng)，防止脂質(zhì)過氧化能力越強(qiáng)[23]。由圖7可知，黑枸杞粗提液(未純化)和純化后的黑枸杞樣品的濃度分別在0.08～0.24 和0.003～0.024 mg/mL時(shí)，其清除DPPH·的能力與其濃度存在明顯的量效關(guān)系，且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，由此可計(jì)算未純化和純化黑枸杞花青素對DPPH·的半數(shù)清除濃度(IC50)分別為0.208和0.011 mg/mL。由此可知，純化后的黑枸杞樣品對DPPH·的清除能力約是黑枸杞粗提液(未純化)的18.9倍，表明純化后的黑枸杞樣品抗氧化能力明顯增強(qiáng)。黑枸杞粗提液(未純化)清除DPPH·的能力與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致，但文獻(xiàn)未考察黑枸杞樣品的純化及純化后對DPPH·的清除能力。

圖7 樣液濃度對DPPH·的清除率(n=3)Fig.7 Scavenging ratio of sample concentration on DPPH free radical (n=3)

2.2.2 ·OH清除能力測定 ·OH可引起DNA、細(xì)胞膜等生物大分子降解，從而破環(huán)細(xì)胞的完整性，是公認(rèn)的毒性最大的自由基[24-25]。由圖8可知，純化后黑枸杞樣品的濃度在2.4～8.4 mg/mL時(shí)，對·OH的清除能力與其濃度存在明顯的量效關(guān)系，且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，由此可計(jì)算其對·OH的IC50為6.24 mg/mL。黑枸杞粗提液(未純化)在2.4～8.4 mg/mL范圍內(nèi)抗氧化呈一定線性關(guān)系，但濃度大于7.2 mg/mL時(shí)對·OH的清除率不再增加，趨于平緩，在濃度為8.4 mg/mL時(shí)，最大清除率僅為38.3%，由此可知，純化后的黑枸杞樣品對·OH的清除率明顯增高，抗氧化能力明顯增強(qiáng)，保護(hù)細(xì)胞的能力增強(qiáng)。黑枸杞粗提液(未純化)與文獻(xiàn)[24]中黑枸杞回流提取液的·OH清除率基本一致，但樣品濃度有差異，這與·OH清除率的測定方法不一致有關(guān)，本文采用的是鄰二氮菲-Fe2+氧化法，而文獻(xiàn)[24]用的是水楊酸法，二者反應(yīng)機(jī)理不同[24]。

圖8 樣液濃度對·OH的清除率(n=3)Fig.8 Scavenging ratio of sample concentration on ·OH radical (n=3)

2.2.3 ABTS+·清除率的測定 水溶性ABTS+·是一種穩(wěn)定的綠色自由基，物質(zhì)對其清除率的能力可以用來表征該物質(zhì)的總抗氧化能力[22,26]。由圖9可知，黑枸杞粗提液(未純化)和純化后的黑枸杞樣品分別在0.1～1.0 和0.01～0.1 mg/mL范圍時(shí)，對ABTS+·的清除能力與其濃度存在明顯的量效關(guān)系，且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，由此可計(jì)算其對ABTS+·的IC50分別為0.476和0.064 mg/mL。由此可知，純化后的黑枸杞樣品對ABTS+·的清除能力約是黑枸杞粗提液(未純化)的7.44倍，表明純化后的黑枸杞樣品抗氧化能力增強(qiáng)，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的抗氧化能力增強(qiáng)倍數(shù)有所差異，這可能與文獻(xiàn)中用的是沒食子酸當(dāng)量濃度的計(jì)算方法有關(guān)。

圖9 樣液濃度對ABTS+·的清除率(n=3)Fig.9 Scavenging ratio of sample concentration on ABTS free radical (n=3)

3 結(jié)論

以2012年山西靜樂縣引進(jìn)試種的黑枸杞為研究對象，通過試驗(yàn)研究了六種大孔樹脂對黑枸杞花青素純化效果的影響，選用HPD100樹脂作為本實(shí)驗(yàn)的篩選對象，當(dāng)樣液初始濃度為0.2 mg/mL、上樣體積為49 mL(7 BV)、洗脫劑乙醇濃度為75%、洗脫劑用量為42 mL(6 BV)時(shí)，黑枸杞花青素純度由2.38%上升到17.82%，提高了7.49倍。分別以DPPH·、·OH和ABTS+·清除法測定黑枸杞提取液純化前后的自由基清除能力，結(jié)果表明黑枸杞粗提液和純化液DPPH·清除能力的IC50值分別為0.208和0.011 mg/mL；對ABTS+·清除能力的IC50值分別為0.476和0.064 mg/mL；黑枸杞粗提液對·OH的最大清除率為38.3%，純化液對·OH的清除能力IC50為6.24 mg/mL；表明經(jīng)純化后黑枸杞花青素的抗氧化能力較純化前有了顯著提高。純化后黑枸杞花青素較強(qiáng)的抗氧化性，故可以作為天然抗氧化劑，且無毒副作用，這對山西靜樂縣黑枸杞的綜合開發(fā)利用具有重要意義。