非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究干燥方式對牡丹花差異蛋白質(zhì)的影響

許 寧，趙悅菡，侯召華,,

(1.山東省農(nóng)業(yè)機械科學(xué)研究院, 山東濟南 250000；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東濟南 250353)

牡丹是我國十大傳統(tǒng)名花之一，為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect. Moutan DC)的多年生落葉灌木，原產(chǎn)于我國，世界各地廣泛種植的牡丹品種均起源于中國[1]。牡丹富含多酚、黃酮、萜類、芳香烴類等多種生物活性成分，具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤，治療糖尿病、腎病、動脈粥樣硬化等作用[2]。牡丹花茶是近年來深受大眾喜愛的花茶飲品之一，需求量顯著增加，但在牡丹花茶制作加工中存在變色、茶色感官接受度低、干制后花香難以保留等問題[3]，這嚴(yán)重影響了牡丹花茶的價值。

目前，牡丹花干燥方式主要為自然干燥、干燥箱熱風(fēng)干燥、真空冷凍干燥、微波干燥等。目前工業(yè)生產(chǎn)主要以熱風(fēng)干燥為主，熱風(fēng)干燥的媒介是空氣，富含氧氣，容易發(fā)生酶促褐變和氧化，引起質(zhì)量變化，但是該方法成本分，易于實現(xiàn)，應(yīng)用最為廣泛。自然干燥容易受環(huán)境條件影響，產(chǎn)品容易皺縮，色澤暗淡，且干燥時間長[3]。真空冷凍干燥是一種新型干燥技術(shù)，應(yīng)用在牡丹花干花的制備上，能很好地保證牡丹花原有的色澤、形狀及產(chǎn)品復(fù)水性[4-5]，但該方法干燥后花瓣非常脆，容易折斷和破碎。目前，不同加工方式對牡丹花干燥的研究，多種在色澤及花色苷黃酮類物質(zhì)含量變化，加工過程中機理變化研究較少。

蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、表達水平、蛋白質(zhì)之間的相互作用及翻譯后的修飾等。利用蛋白質(zhì)組學(xué)可探索蛋白質(zhì)的調(diào)控規(guī)律，從而更加全面地掌握生命現(xiàn)象和本質(zhì)，了解生命活動的規(guī)律[6]?；谫|(zhì)譜檢測技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)有兩種：標(biāo)記定量技術(shù)(Labeling quantitation)和非標(biāo)記定量技術(shù)(Label free quantitation)。非標(biāo)記定量技術(shù)指不對樣本進行標(biāo)記，樣本酶解產(chǎn)物分別進行質(zhì)譜分析，然后根據(jù)峰面積或者肽段總次數(shù)對肽段和蛋白質(zhì)進行相對定量。非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求較高；實驗耗費低，無需昂貴的同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)；對樣本的操作也最少，從而使其最接近原始狀態(tài)，并且不受樣品條件的限制，可以克服標(biāo)記定量技術(shù)在對多個樣本進行定量方面的缺陷[7]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)越來越多應(yīng)用于植物保鮮加工等領(lǐng)域，在蛋白質(zhì)水平上探討加工作用機理。李新明等[8]采用Label free技術(shù)分析了蘋果片在干制條件下及復(fù)合護色劑處理后果肉中蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，為復(fù)合護色劑應(yīng)用于果蔬護色提供科學(xué)依據(jù)。

本文利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對真空冷凍干燥、自然干燥和熱風(fēng)干燥牡丹花進行蛋白質(zhì)組學(xué)的差異性比較，研究不同干燥技術(shù)對牡丹花的作用機理，以期為牡丹花的干燥方式及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹鳳牡丹 來源于山東聊城東阿魯油牡丹公司，2020年4月20日采摘于公司基地，2 h內(nèi)進入實驗室處理；胰蛋白酶Sequencing grade modified trypsin V5111(14369 U/mg) 普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司；三氯乙酸TCA、丙酮、二硫蘇糖醇DTT、碘乙酰胺Iodoacetamide、尿素Urea、碳酸氫銨NH4HCO3均為分析純，Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸(均為質(zhì)譜級)，三氟乙酸TFA(色譜級) Thermo Fisher公司。

Ultimate 3000 RSLC Nano液相色譜儀、Q Exactive HF納升液相色譜-四極桿串聯(lián)靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀(QEHF，Orbitrap 240000FWHM) 美國賽默飛世爾科技有限公司；Allgera X-30R冷凍高速離心機 美國Beckman公司；BTP8ZL真空冷凍干燥器 美國SP Scientific公司；BILON-650Y超聲波細胞粉碎機 上海比朗儀器制造有限公司；MDF-U3386S超低溫冰箱 日本三洋；Milli-Q Reference超純水儀 密理博中國有限公司；GZX-150BS-III生化培養(yǎng)箱 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；賽多利斯Q-124cn電子天平 賽多利斯上海貿(mào)易有限公司；μ-Precolumn捕集柱(300 μm×5 mm,C18PepMap 100, 5 μm, 100 ?) Thermo Scientific；Acclaim PepMapTMRSLC 分析柱(75 μm×15 cm,nanoViper, C18, 2 μm, 100 ?) Thermo Scientific；10 kDa超濾離心管(10 kDa，0.5 mL) 密理博中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗流程

樣品處理及試驗流程如圖1所示。

圖1 樣品處理及試驗流程Fig.1 Workflow for sample preparation and experiment

1.2.2 牡丹花干燥

1.2.2.1 真空冷凍干燥(Freeze-drying，F(xiàn)D) 牡丹鮮花在超低溫冰箱-80 ℃下冷凍8 h以上，放入真空冷凍干燥器中，冷阱-103～-105 ℃，冷凍干燥24 h。干燥樣品粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2.2 熱風(fēng)干燥(Hot-air drying，HD) 牡丹鮮花迅速放置在鼓風(fēng)干燥箱中，溫度70 ℃，時間16～18 h。干燥樣品粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2.3 自然干燥(Natural drying，ZD) 牡丹鮮花放置在托盤上，直接晾曬，48 h。干燥樣品粉碎，過60目篩，備用。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取及分析 蛋白質(zhì)提取及分析方法參考文獻[9-10]，略有改動。稱取3 g樣品粉末，放入50 mL離心管，加入5倍體積-20 ℃預(yù)冷丙酮(含體積分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸TCA和0.07%β-巰基乙醇)；勻漿旋渦混勻后于-20 ℃放置4 h以上；10000×g，4 ℃，離心30 min，棄去上清液，得到蛋白質(zhì)沉淀；沉淀用100%預(yù)冷丙酮5 mL，清洗3次，10000×g，4 ℃，離心15 min；待沉淀中丙酮氮氣吹干后，得到蛋白質(zhì)粗提物。取約0.25 g蛋白質(zhì)粗提物溶解在2.5 mL尿素裂解液(5 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，2% CHAPS, 2% SB-3-10，1% PMSF,20 mmol/L DTT)，超聲波破碎處理(50%功率，工作2 s，間歇3 s，循環(huán)5～10 min)；處理后，14000×g，20 ℃，離心40 min，得到上清液，過0.45 μm濾膜過濾，得到蛋白質(zhì)溶液，考馬斯亮藍法定量分析，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白質(zhì)酶解 蛋白質(zhì)樣品酶解采用超濾輔助樣品制備(Filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP)[11-12]。取上述提取蛋白質(zhì)樣品100 μg放入10 kDa超濾膜離心管中，14000×g，室溫下離心15 min；離心過后，超濾管中加入 0.1 mL 100 mmol/L DTT-50 mmol/L NH4HCO3溶液，在50 ℃生化培養(yǎng)箱中，保持30 min；14000×g，室溫下離心15 min；然后超濾管中加入100 μL 50 mmol/L iodoacetamide-UA buffer(8 mmol/L urea，150 mmol/L Tris‐HCl，pH8.0)溶液，30 ℃，避光保持40 min后，14000×g離心；接著用100 μL UA-buffer重復(fù)離心沖洗三次，每次14000×g，室溫離心15 min；然后用100 μL 50 mmol/L NH4HCO3沖洗，重復(fù)離心3次；然后取100 μL胰蛋白酶-50 mmol/L NH4HCO3溶 液(胰 蛋 白 酶∶蛋 白質(zhì)=1∶25)，加入到超濾管中，37 ℃生化培養(yǎng)箱，過夜15 h；然后加入2 μL甲酸終止反應(yīng)5 min。14000×g，20 ℃，離心40 min，得到離心液，用C18Cartridge肽段脫鹽，待QEHF檢測。

1.2.5 質(zhì)譜分析 樣品分析根據(jù)Soares等[13]的方法，略有修改。利用Q Exactive HF納升液相色譜-四極桿串聯(lián)靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀(QEHF,Orbitrap 240000 FWHM)對酶解肽段混合物進行分析。多肽段載入捕集柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap 100，100 μm×2 cm, nanoViper C18)，然后進入C18分析柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap 100, 15 cm×75 μm, 3 μm)；納升液相，流動相A為0.1%甲酸溶液；B為80%乙腈0.1%甲酸溶液。流速 為300 nL/min；梯 度120 min；0～3 min，4%B；3～100 min，4%～34%B；100～115 min，34%～45%B；115～120 min，99%；

質(zhì)譜采用離子源為陽離子模式；DDA模式數(shù)據(jù)采集；一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率120000 FWHM，掃描范圍150～1800 m/z；動態(tài)排阻時間30 s；掃描次數(shù)20；二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率15000 FWHM，掃描范圍150～1800 m/z；標(biāo)準(zhǔn)碰撞能27 eV。

1.2.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)利用軟件Proteome Discoverer(PD, ver. 2.2, Thermo Scientific,Bremen, Germany)進行搜庫，目標(biāo)蛋白質(zhì)來自UniProtKB/Swiss-Protpaeonia database (release 2020_07, 394421 total entries, downloaded 07/18/20)。搜庫參數(shù)設(shè)置[14]：酶切特異性：賴氨酸精氨酸；酶切允許2個漏切位點；肽段>6個氨基酸長度；母離子質(zhì)量精度：20 ppm；碎片離子精度20 ppm；半胱氨酸烷基化(C)為固定修飾；甲硫氨酸氧化(M)、乙酰化修飾、脫氨基為可變修飾；肽段和蛋白質(zhì)FDR<0.01；Razor和unique peptides用于蛋白質(zhì)定量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Perseus軟件(版本號：1.6.5.0)對搜庫數(shù)據(jù)結(jié)果進行顯著分析、主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)、層次聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)[15]。蛋白質(zhì)含量豐度進行數(shù)值轉(zhuǎn)化log2-transformed，Z-scores中心化，并且缺失值正態(tài)分布填充(width 0.3，downshift 1.8)；Benjamini-Hochberg FDR<0.01。

1.3 差異蛋白質(zhì)（Differential Expression Proteins,DEPs）生物信息學(xué)分析

差異倍數(shù)Fold change(FC)≥2，P<0.05或FC≤0.5，P<0.05為差異蛋白質(zhì)[16]。差異蛋白質(zhì)的GO注釋富集分析、KEGG注釋富集分析、PPI通過在線分析軟件Omicsbean (http://www.omicsbean.cn)進行分析[17]，圖片利用cytoscape3.7.0 進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)分析

2.1.1 蛋白質(zhì)鑒定及定量結(jié)果 本研究共定性蛋白質(zhì)1423個，定量1349個，占總數(shù)的94.80%。FD、HD、ZD定量蛋白質(zhì)分別為1325、677、1085個，三組樣品共有定量蛋白質(zhì)為656個(圖2)。

圖2 三種牡丹花瓣樣品中蛋白質(zhì)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of proteins in three different peony sample

2.1.2 主成分分析(PCA)和層析聚類(HCA)數(shù)據(jù)分析 用PCA法對9個樣本蛋白質(zhì)做分析。數(shù)據(jù)中多元變量通過計算使其按照方差依次遞減的順序排列，得到的第一變量表示數(shù)據(jù)中最大的方差，稱為第一主成分(PC1)，第二主成分(PC2)表示方差次之，經(jīng)過軟件計算得到得分圖(圖3)。熱圖(heatmap)可簡單聚合大量數(shù)據(jù)，將結(jié)果以一種漸進的色帶直觀地展現(xiàn)出來，可看出數(shù)據(jù)的疏密和頻率高低程度[18]。

由圖3得分圖可知，新生成的變量PC1、PC2能夠解釋說明數(shù)據(jù)96.5%的變化，9個樣本被顯著地分成3類，F(xiàn)D01、FD02、FD03歸于一類；ZD01、ZD02、ZD03歸于一類，HD01、HD02、HD03歸于一類，這表明相同干燥方式樣本歸為一類，加工方式對牡丹花蛋白質(zhì)有顯著影響。同時凍干樣品與自然干燥又可以聚成一簇，表明兩組樣品蛋白質(zhì)相似；這兩種干燥方法都屬于低溫干燥方式，可能溫度能顯著影響蛋白質(zhì)組成及含量。

圖3 三組樣品中656個共有定量蛋白質(zhì)主成分分析和層次聚類熱圖Fig.3 PCA score plot and heatmap of 656 proteins of peony

2.2 生物信息學(xué)分析

對HD和ZD樣品中656個蛋白質(zhì)進行分析，得到顯著差異蛋白質(zhì)77個，與HD相比較，ZD有24個蛋白質(zhì)表達上調(diào)，53個蛋白質(zhì)表達下調(diào)(圖4和表1)。

圖4 ZD/HD牡丹樣品中蛋白質(zhì)火山圖和77個差異蛋白質(zhì)聚類圖Fig.4 ZD/HD volcano plot of peony proteins and heatmap of 77 DEPs

對77個差異蛋白質(zhì)進行GO、KEGG注釋及富集分析、蛋白質(zhì)互作分析(protein-protein interaction，PPI)，參考生物為擬南芥。

2.2.1 GO注釋富集分析 GO分析已成為生物信息領(lǐng)域中一個重要的方法和工具，它通過利用本體所代表的生物學(xué)信息，從而實現(xiàn)了對生物體中各種基因組產(chǎn)物(例如基因、蛋白質(zhì)等)生物學(xué)功能的描述[19]。

將77個DEPs與GO數(shù)據(jù)庫比對，分別注釋到生物學(xué)過程(biological process)、細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)；如圖5所示，DEPs在GOTerms上富集情況如下：在生物學(xué)過程中，富集最多差異表達蛋白質(zhì)依次是“細胞代謝過程(cellular metabolic process)”12%、“有機物質(zhì)代謝過程(Organic substance metabolic process)11%”、“初級代謝過程(primary metabolic process)”10%、“單一生物細胞過程(single-organism cellular process)”10%、“單一生物代謝過程(single-organism metabolic process)”8%，其余為“生物合同過程(biosynthetic process)”、“細胞成分組成(cellular component organization)”、“壓力響應(yīng)(response to stress)”、“化學(xué)響應(yīng)(response to chemical)”、“分解代謝過程(catabolic process)”等；在細胞組分中，富集最多DEPs是“細胞內(nèi)部分(intracellular part)”20%、“細胞內(nèi)(intracellular)”20%、“膜細胞器(membranebounded organelle)”17%等；在分子功能方面，富集最多DEPs的是“其他分子功能(other molecular function)”32%、“蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)”27%、“氧化還原活性(oxidoreductase activity)”18%、“輔助因子結(jié)合(cofactor binding)”8%、“核糖體結(jié)構(gòu)組件(Structural constituent of ribosome)”8%等。

表1 顯著差異蛋白質(zhì)相關(guān)代謝通路信息Table 1 Related metabolic pathway information of differential expression proteins

圖5 GO功能注釋及富集分析Fig.5 Functional annotation and enrichment analysis of Go function

2.2.2 KEGG注釋富集分析 為分析差異表達蛋白質(zhì)參與的生物途徑，采用KEGG數(shù)據(jù)庫以DEPs進行生物功能途徑的富集分析。圖6所示，KEGG pathway富集到44個代謝通路，其中5條極顯著(P<0.01)代謝通路：“糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)”，“碳代謝(carbon metabolism)”、“丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)”、“三羧酸循環(huán)(citrate cycle TCA cycle)”、“丙酸代謝(Propanoate metabolism)”?；驁D表明，權(quán)重最高(大于0.8)的主要為：二氫硫酰胺脫氫酶(LPD1)、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(LPD2)屬于丙酮酸代謝通路；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPCP2)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(PGI1)、丙酮酸激酶(PKP1)、丙酮酸激酶(At3g52990)屬于糖酵解通路；NADP-異檸檬酸脫氫酶(At5g14590)、線粒體琥珀酸-CoA連接酶β亞基(At2g20420)屬于三羧酸循環(huán)通路；HSP90-2、MED37A、RAD23B屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工；酮醇酸還原異構(gòu)酶(At3g58610)屬于氨基酸生物合成通路；3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IMDH2)屬于2-氧代羧酸代謝通路。

圖6 KEGG富集分析分布Fig.6 Distribution of enriched KEGG pathway

2.2.3 蛋白質(zhì)互作分析PPI 最大節(jié)點數(shù)設(shè)定30，分?jǐn)?shù)閾值0.7，差異表達蛋白質(zhì)互作分析如圖7所示。互作最顯著20個蛋白質(zhì)，涉及10個代謝通路，最顯著通路為糖酵解/糖異生。20個蛋白質(zhì)為LPD1、At3g52990、LPD2、PKP1、At2g20420、PGI1、At3g58610、GAPCP2、NAD-ME1、IMDH2、MED37A、RAD23B、HSP90-2、CRT1、CDC48E、At5g14590、PYD2、HSP25.3、At5g28840、At5g47。

3 討論

3.1 代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

鮮花采摘后仍是一個有機生命體，脫離了母體和栽培環(huán)境后同化作用基本停止，但有機體仍在進行呼吸作用。干燥過程中，尤其是熱干燥下，會產(chǎn)生一系列代謝活動。本研究中ZD樣品與HD樣品的差異蛋白質(zhì)主要涉及代謝相關(guān)通路(P<0.01)包括“糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)”，“碳代謝(carbon metabolism)”、“丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)”、“三羧酸循環(huán)(citrate cycle TCA cycle)”、“丙酸代謝(Propanoate metabolism)”。這五個通路是能量代謝的核心通路。能量和物質(zhì)代謝是生物體基本的生命活動現(xiàn)象，一些共同的代謝反應(yīng)如糖酵解、三羧酸循環(huán)以及一些氨基酸的合成等普遍存在于植物體內(nèi)各個器官和組織中，這些代謝活動的強弱直接反應(yīng)著植物的生存情況[20]。

糖酵解代謝(EMP)是碳水化合物代謝的主要途徑，是將葡萄糖和糖原降解為丙酮酸并伴隨著ATP生成的一系列反應(yīng)，是一切生物有機體中普遍存在的葡萄糖降解的途徑，是葡萄糖進行有氧或無氧分解的共同代謝途徑。本研究中糖酵解通路中蛋白質(zhì)主要是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPCP2)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(PGI1)、丙酮酸激酶(PKP1、At3g52990)。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是產(chǎn)生糖酵解途徑最終產(chǎn)物丙酮酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。PK的底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和產(chǎn)物丙酮酸可參與多種代謝途徑，因此被認(rèn)為在細胞代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PK是植物糖酵解和乙醛代謝途徑中的關(guān)鍵作用酶，可將ADP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)不可逆地轉(zhuǎn)化為ATP和丙酮酸[21]。PK、GAPCP2、PGI1的活性提高能促進糖酵解(EMP)、三羧酸循環(huán)(TCA)、磷酸戊糖途徑(PPP)途徑的運轉(zhuǎn)效率，保證了細胞的物質(zhì)代謝和能量供應(yīng)[22]。與烘干樣品比較，自然風(fēng)干樣品中PGI1、GAPCP、PK顯著上調(diào)，表明自然風(fēng)干過程中EMP顯著上調(diào)，產(chǎn)生更多能量。

二氫硫酰胺脫氫酶(LPD1)、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(LPD2)屬于丙酮酸代謝通路。丙酮酸進入線粒體，在丙酮酸脫氫酶的作用下，形成乙酰CoA，進入三羧酸循環(huán)。三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，分布在線粒體[23]。NADP-異檸檬酸脫氫酶 (At5g14590)、線粒體琥珀酸-CoA連接酶β亞基(At2g20420)屬于三羧酸循環(huán)；這兩種酶顯著增加，表明自然干燥技術(shù)產(chǎn)生更多能量。

圖7 蛋白質(zhì)互作分析Fig.7 Protein-protein interaction analysis

在能量代謝相關(guān)酶類中，3-異丙基蘋果酸脫氫酶(3-isopropylmalatedehydrogenase)(IMDH2)是一種亮氨酸生物合成中重要特定的酶，其是通過利用NAD+作為氧化劑催化(2R，3S)-3-異丙基蘋果酸的氧化和脫羧反應(yīng)形成α-酮異己酸，生成NADH，其活性受二價金屬離子如Mg2+或Mn2+等的影響[24-25]。3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IMDH2)參與幼果體內(nèi)的糖代謝酶促反應(yīng)，除了提供能量之外，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可以參與其它代謝反應(yīng)，如通過中間產(chǎn)物草酰乙酸參與到氨基酸合成途徑中，進而合成蛋白質(zhì)，影響內(nèi)源激素的代謝[26]。

自然干燥和熱風(fēng)干燥牡丹花，均為升溫過程，進行一系列生物體代謝，然而自然風(fēng)干升溫溫和，機體內(nèi)生物代謝劇烈；熱風(fēng)干燥迅速升溫并保持70 ℃以上，該溫度會造成大多酶失活。

牡丹花受到高溫脅迫會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，它們能破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，從而導(dǎo)致牡丹花氧化還原失衡、生理活動紊亂?？寡趸?CSD1、CSD3超氧化物歧化酶)可以清除自由基及過氧化物，從而使用細胞內(nèi)氧化還原及生理活動恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)[27]。

3.2 Genetic information processing相關(guān)蛋白質(zhì)

6個差異蛋白質(zhì)涉及到“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)”通路，其中最為重要是熱激蛋白。高等植物無法適應(yīng)長期遭受超過45 ℃的高溫。在高溫脅迫條件下，植物細胞中蛋白質(zhì)失去生物活性可能歸因于蛋白質(zhì)聚集或蛋白質(zhì)錯誤折疊或兩者都有。應(yīng)激誘導(dǎo)的聚集和錯誤折疊蛋白的積累過程是不可逆的，而且對細胞功能造成傷害[28]。

翻譯后修飾主要是指蛋白質(zhì)折疊、加工和降解，完成這一調(diào)節(jié)功能的主要是熱激蛋白類(Heat shock proteins，HSP)，它是一種分子伴侶，能夠穩(wěn)定未變性蛋白，防止變性蛋白聚集或者幫助變性蛋白重折疊，幫助新生肽折疊成有功能的蛋白，協(xié)助使錯誤折疊的蛋白發(fā)生降解。HSP90家族的蛋白質(zhì)占植物細胞總蛋白的1%～2%，其在細胞蛋白中是組成型表達，在非生物脅迫下(主要是高溫脅迫)，應(yīng)激蛋白HSP90的表達程度與脅迫程度呈正相關(guān)[29-31]。同時，HSP90蛋白還具備一定的緩沖作用，如正常條件下，該基因不會被大量表達，然而當(dāng)植物體受到環(huán)境脅迫，其緩沖作用就會體現(xiàn)出來，導(dǎo)致植物出現(xiàn)遺傳變異，進而有效適應(yīng)不利環(huán)境[30]。研究表明HSPs在細胞內(nèi)具有抗氧化的生物活性，其可以激活蛋白激酶，增強蛋白酶活性，促進SOD的生成，從而使細胞抗過氧化物的傷害，對細胞起修復(fù)和保護作用，從而有效提高機體的耐受性和抗應(yīng)激能力[24]。

4 結(jié)論

本研究共定性蛋白質(zhì)1423個，定量1349個，占總數(shù)的94.80%。FD、HD、ZD定量蛋白質(zhì)分別為1325、677、1085個，三組樣品共有定量蛋白質(zhì)656個。PCA和HCA分析表明，F(xiàn)D、ZD、HD樣品均各歸于一類，這表明加工方式對牡丹花蛋白質(zhì)有顯著影響；同時凍干樣品與自然干燥又可以聚成一簇，表明兩組樣品蛋白質(zhì)相似。

差異表達蛋白質(zhì)DEPs的GO、KEGG注釋及富集分析，涉及到5個極顯著(P<0.01)代謝通路，其中最顯著代謝通路為“糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)”，“碳代謝(carbon metabolism)”、“丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)”、“三羧酸循環(huán)(citrate cycle TCA cycle)”、“丙酸代謝(Propanoate metabolism)”。自然風(fēng)干樣品升溫緩和，PGI1、PKP1、GAPCP2、LPD1、LPD2顯著促進糖酵解、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等通路，讓牡丹花保持良好狀態(tài)；HSP90在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路中顯著增加，這表明細胞啟動應(yīng)激反應(yīng)，保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。熱風(fēng)干燥升溫劇烈，可能蛋白質(zhì)在產(chǎn)生進一步生化反應(yīng)之前，已經(jīng)喪失活性。