摩洛哥發(fā)酵橄欖汁中乳酸菌的分離鑒定及其多樣性研究

劉文俊，韓 菲，史 迪，劉 琛，柳 青，郭 琳，李 瑜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

橄欖又名青欖、青果，是一種常綠喬木樹(shù)種且具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，橄欖果風(fēng)味獨(dú)特，富含多種活性物質(zhì)，且極具地域特色，對(duì)于改善腸道菌群、養(yǎng)膚護(hù)膚以及預(yù)防慢性病等方面有著良好的作用[1]。近些年人們開(kāi)始深入研究橄欖的精加工制品，目前存在的主要產(chǎn)品有果脯蜜餞、橄欖汁、橄欖油等[2]。其中，新型飲料橄欖汁不僅有獨(dú)特的口感，而且還具有保肝、醒酒、護(hù)喉等功效[3]，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。

眾所周知摩洛哥有橄欖之鄉(xiāng)的美稱(chēng)，由于摩洛哥地區(qū)降水量少，光照充足，所以十分利于橄欖生長(zhǎng)。獨(dú)特的地域、氣候孕育了獨(dú)特的植物、動(dòng)物和微生物，發(fā)酵橄欖汁這一具有獨(dú)特地域特色的食品必然有其特有的乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)，然而關(guān)于發(fā)酵橄欖汁中乳酸菌多樣性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

傳統(tǒng)植物性發(fā)酵食品中孕藏著豐富的乳酸菌資源，其中常見(jiàn)的乳球菌屬中的Lactococcus lactis、乳桿菌屬中的Lactobacillus plantarum在植物性發(fā)酵食品和發(fā)酵飲料中常常被分離到，并且應(yīng)用廣泛。例如：任沛東等[4]在自然發(fā)酵苦菜中篩選并鑒定出5株高產(chǎn)酸、益生特性較好的植物乳桿菌，可廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的生產(chǎn)；朱珺等[5]篩選出植物乳桿菌581具有潤(rùn)腸通便功能和良好的發(fā)酵特性，可用于具有益生功能的果蔬發(fā)酵飲料的開(kāi)發(fā)。在食品行業(yè)中乳酸乳球菌由于益生特性較好且可以產(chǎn)生無(wú)毒的食品防腐劑乳鏈菌肽而被廣泛應(yīng)用[6]，在食品行業(yè)前景廣闊。因此，從自然發(fā)酵食品中分離乳酸菌具有重要研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

本文利用純培養(yǎng)方法結(jié)合宏基因組16S rRNA測(cè)序技術(shù)研究摩洛哥地區(qū)自然發(fā)酵制品中的乳酸菌多樣性，同時(shí)采用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)分析細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保存摩洛哥地區(qū)自然發(fā)酵制品乳酸菌資源，以期為優(yōu)良菌株篩選及其工業(yè)化應(yīng)用提供寶貴的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2份發(fā)酵橄欖汁樣品 均來(lái)自摩洛哥卡薩布蘭卡地區(qū)(西經(jīng)7°41’，北緯33°32’)，將樣品編號(hào)為GL1和GL2；TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；KAPA HiFiHot-StartReady Mix PCR試劑盒 美國(guó)KAPA公司；5×TBE電泳緩沖液 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基及其他試劑具體信息 參考文獻(xiàn)[7]。

CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；ND-1000型微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司；AB/Life梯度PCR儀 美國(guó)AB公司；Pacifico SMRT RS II測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)PB公司；其他儀器具體信息 參考文獻(xiàn)[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 采集一式兩份發(fā)酵橄欖汁樣品，一份加至已有碳酸鈣和可溶性淀粉的無(wú)酶無(wú)菌采樣管中(m碳酸鈣∶m淀粉=1∶50)，用于樣品中乳酸菌的分離鑒定；另一份加至無(wú)酶無(wú)菌的樣品采集管中，加入DNA保護(hù)劑后，充分混勻，用液氮快速冷凍，密封移至低溫冷采樣箱，采集好的樣品密封并標(biāo)號(hào)，在低溫條件下保存并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用于乳酸菌分離的樣品到實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行菌株分離，用于菌株多樣性測(cè)序的樣品冷凍保存后進(jìn)行DNA提取和后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并將提取DNA的樣品在-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌的計(jì)數(shù) 取混勻的0.5 mL樣品于4.5 mL濃度為0.85%的滅菌生理鹽水中，采用稀釋涂布平板法對(duì)2份樣品進(jìn)行乳酸菌活菌計(jì)數(shù)。取稀釋梯度為10-5、10-6、10-7的稀釋液于玻璃平皿中并加入30 mL加有放線菌酮和多粘菌素的MRS固體培養(yǎng)基采用八字搖勻法搖勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48～72 h。

1.2.3 乳酸菌的分離純化及保存 配制加有0.1%抑菌素(V放線菌酮∶V多粘菌素=1∶1)的MRS和RCM的固體培養(yǎng)基，在121 ℃、15 min的條件下滅菌后使用，在培養(yǎng)基中加入放線菌酮和多粘菌素是為了在培養(yǎng)過(guò)程中抑制真菌和霉菌的生長(zhǎng)，從而更好地分離出乳酸菌[8]。

采用稀釋涂布平板法，將稀釋梯度為10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液均勻涂布在RCM和MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h[9]。待菌落形成后，觀察菌落形狀、邊緣凹凸情況、光滑度等特征，選取形狀、大小等特征不同的單個(gè)菌落，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行二次劃線純化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)菌株在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，因此將純化后的單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h后，將培養(yǎng)基離心倒掉上清加0.85%的滅菌生理鹽水進(jìn)行兩次洗菌。取部分菌體涂片并進(jìn)行革蘭氏染色，之后在顯微鏡下觀察，將革蘭氏染色陽(yáng)性，排列均一的菌株暫定為乳酸菌，并在剩余的菌泥中加入脫脂乳保護(hù)劑于無(wú)菌安瓿管中抽真空冷凍干燥后于-80 ℃保存[10]。

1.2.4 菌株DNA的提取、擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 使用TIANampBacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離純化后并鑒定為乳酸菌的菌株DNA，使用方法詳見(jiàn)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。提取完畢后對(duì)DNA濃度和純度以及DNA提取質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

將檢測(cè)合格的基因組DNA稀釋至100 ng/μL作為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增[11]。PCR擴(kuò)增采用通用引物，正向引物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')，反向引物為1492R (5'-ACCTTGTTACGACTT-3')，PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系(50 μL)和擴(kuò)增條件參照喬健敏等[12]的16S rRNA基因序列擴(kuò)增條件。

擴(kuò)增完畢后，取約2 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠[12]進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1500 bp處有清晰條帶，并無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象，視為16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物滿足測(cè)序要求。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，在低溫條件下寄到上海美吉生物技術(shù)有限公司，進(jìn)行雙向測(cè)序。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(National Center for Biotechnology Information)將測(cè)序得到的菌株16S rRNA基因序列與模式株進(jìn)行同源性比對(duì)，將同源性結(jié)果大于99%的菌株視為與模式菌株屬于同一菌種。用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化研究[13]。

1.2.5 樣品宏基因組DNA的提取及文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 使用OMEGA eZNA Soil DNA Kit試劑盒提取發(fā)酵橄欖汁樣品中基因組的DNA，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。檢驗(yàn)樣品DNA的完整度、純度以及濃度，將合格的樣品置于-20 ℃冰箱備用。

使用KAPA HiFiHotStart Ready Mix PCR Kit將DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增使用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F(5-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3')1492R (5'- ACCTTGTTACGACTT-3')，擴(kuò)增條件和PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系如下。加入等體積的AMPure? PB 磁珠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的片段用Qubit＠ dsDNA HS Assay Kit試劑盒檢測(cè)DNA濃度，DNA濃度需在20～100 ng/μL。

具體PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系(50 μL)和擴(kuò)增條件參照劉文俊等[7]文獻(xiàn)中條件。

經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物通過(guò)Pacific Biosciences SMRT bell TM Template Prep Kit試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，用PacBio RS II儀器上機(jī)測(cè)序，按說(shuō)明書(shū)具體操作，并分析結(jié)果[14]。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 根據(jù)標(biāo)記的Barcode將原始序列劃分到每個(gè)樣品中，然后去掉Barcode和引物序列，使用QIIME平臺(tái)(v1.70)對(duì)高質(zhì)量的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。具體分析過(guò)程參照劉文俊等[7]生物信息學(xué)分析過(guò)程。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果

對(duì)摩洛哥地區(qū)采集的兩份發(fā)酵橄欖汁進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)，結(jié)果為GL1活菌數(shù)為2.76±0.02 lg CFU/mL，GL2活菌數(shù)為2.92±0.09 lg CFU/mL。

結(jié)果表明，采集的2份發(fā)酵橄欖汁樣品的乳酸菌活菌數(shù)在2.76～2.92 lg CFU/ml之間。可以看出兩份樣品中活菌數(shù)相差不大，說(shuō)明在樣品采集、運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)樣品的保護(hù)較好，并沒(méi)有發(fā)生較大的活菌損失。

2.2 分離株菌落表型特征

采用純培養(yǎng)方法對(duì)本研究中的2份發(fā)酵橄欖汁制品進(jìn)行乳酸菌活菌分離及鑒定，通過(guò)顯微鏡觀察、革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)將分離到的52株分離菌株初步暫定為乳酸菌，其中包括24株桿菌。在分離過(guò)程中觀察菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其表面光滑或粗糙、菌落邊緣整齊、中央有凸起。之后進(jìn)行革蘭氏染色呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性，在顯微鏡下觀察顯示，呈單個(gè)、鏈狀或分散狀均勻排列(如圖1)，由此初步斷定為乳酸菌。最終篩選出52株乳酸菌，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 乳酸菌顯微鏡檢圖片(1000×)Fig.1 Micrograph of lactic acid bacteria under microscope(1000×)

2.3 分離株DNA提取及PCR擴(kuò)增效果分析

提取乳酸菌基因組DNA，并檢測(cè)基因組DNA的濃度，結(jié)果表明所有分離株的基因組DNA的濃度均在100～1000 ng/L之間，純度值(A260/A280比值)在1.8～2.0范圍內(nèi)。運(yùn)用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，結(jié)果顯示大約在1500 bp的位置有一條清晰明亮的條帶，該條帶完整性較好，排列較為整齊，明亮且無(wú)拖尾(如圖2)，因此菌株基因組PCR產(chǎn)物符合實(shí)驗(yàn)的要求。

圖2 部分分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agar-sugar gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR amplification for partially isolates

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建和乳酸菌鑒定結(jié)果

測(cè)序得到的16S rRNA基因序列應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)，如若菌株與模式株序列同源性高于98%可將其歸為同一類(lèi)。如表1所示，52株菌中，有22株被歸類(lèi)于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，17株被歸類(lèi)為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，7株被歸類(lèi)于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，6株被歸類(lèi)于糞腸球菌(Enterococcus faecium)。

表1 摩洛哥地區(qū)自然發(fā)酵橄欖汁中乳酸菌分離株數(shù)量Table 1 The number of isolates of lactic acid bacteria in naturally fermented olive juice in Morocco

將52株自然發(fā)酵橄欖汁中乳酸菌分離株的16S rRNA基因序列，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上傳。

Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和菌株遺傳進(jìn)化比對(duì)結(jié)果如圖3所示。本研究將52株分離株鑒定為乳酸菌的3個(gè)屬4個(gè)種。IMAU98344、IMAU98358等菌株與模式菌株Lactobacillus paracaseisubsp.paracaseiATCC 25302T(D79212.1)聚為一類(lèi)，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus paracasei。IMAU98077、IMAU98141等菌株與模式菌株Lactococcus lactissubsp. lactisATCC 19435T(AB100803.1)聚為一類(lèi)，且同源性為99%，故將其鑒定為L(zhǎng)actococcus lactissubsp.lactis。IMAU98357、IMAU98360等菌株與模式菌株Lactobacillus plantarumATCC 14917T(AF404710.1)聚為一類(lèi)，同源性為99%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum。菌株IMAU98386與模式菌株Enterococcus faeciumATCC 19434T(AB012213.1)聚為一類(lèi)，同源性為99%，故將其鑒定為Enterococcus faecium。

圖3 摩洛哥地區(qū)自然發(fā)酵橄欖汁中部分分離株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the isolates from naturally fermented olive juice in Morocco

由表1可以看出，共分離出52株乳酸菌，其中樣品GL1共分離出24株，包含11株Lactobacillus plantarum，2株Lactobacillus casei(paracasei)，9株Lactococcus lactis，2株Enterococcus faecium。樣品GL2共 分 離 出28株 乳 酸 菌，包 含13株Lactococcus lactis，6株Lactobacillus plantarum，5株Lactobacillus casei(paracasei)，4株Enterococcus faecium，各樣品菌株豐富度比較見(jiàn)圖4。

2.5 發(fā)酵橄欖汁中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)對(duì)PacBio SMRT測(cè)序所得序列進(jìn)行篩選后，本研究中兩份樣品基因組DNA中共獲得2501條高質(zhì)量的序列，在門(mén)水平上，共檢測(cè)到5個(gè)細(xì)菌門(mén)分別是變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcu-Thermus)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，平均相對(duì)含量分別是83.61%、14.67%、1.00%、0.62%、0.08%；在屬水平上，共鑒定到40個(gè)細(xì)菌屬，主要菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)。如圖5所 示，樣 品GL1Lactobacillus的 相 對(duì) 含 量 為48.61%，Lactococcus的相對(duì)含量為27.10%，樣品GL2Lactobacillus的相對(duì)含量為61.69%，Lactococcus的相對(duì)含量為18.41%。相對(duì)含量大于1%的菌屬還包括Shigella、Escherichia、Pediococcus、Acinetobacter、Pseudomonas等。在種水平上，共鑒定到80個(gè)細(xì)菌種，主要菌種有Lactococcus lactis、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei等，其中GL1的相對(duì)含量分別為21.43%、14.52%、9.22%、4.98%，GL2的相對(duì)含量分別為23.83%、19.00%、7.46%、10.78%(如圖6)。

2.6 優(yōu)勢(shì)種屬分析

2份摩洛哥發(fā)酵橄欖汁樣品共分離出52株乳酸菌，分別為4個(gè)種。比較純培養(yǎng)方法與PacBio SMRT測(cè)序檢測(cè)方法，兩種方法鑒定到的菌種屬相對(duì)含量比較如表2所示，運(yùn)用純培養(yǎng)方法與PacBio SMRT測(cè)序檢測(cè)方法鑒定出的最優(yōu)勢(shì)菌屬均為L(zhǎng)actobacillus，分別占比為46.15%、55.15%；在種水平上兩份樣品共分離出22株Lactococcus lactis，占總分離株的42.31%，基于PacBio SMRT測(cè)序檢測(cè)方 法 鑒 定 出Lactococcus lactis占 比 最 高，為22.63%，說(shuō)明Lactococcus lactis為摩洛哥地區(qū)發(fā)酵橄欖汁制品中乳酸菌的優(yōu)勢(shì)種。其次還分離出16株Lactobacillus plantarum、7株Lactobacillus casei(paracasei)和6株Enterococcus faecium，占比分別為32.69%、13.46%和11.54%。由表2結(jié)果可以看出PacBio SMRT測(cè)序檢測(cè)方法檢測(cè)出Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei(paracasei)、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae、Enterococcus faecium和Pediococcus acidilactici，占比分別為0.04%、7.88%、16.76%、8.34%、7.21%、0.04%和4.13%，其中Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae和Pediococcus acidilactici等 在純培養(yǎng)的過(guò)程中均沒(méi)有被分離出，原因可能是這些菌種活菌含量較少，在純培養(yǎng)時(shí)沒(méi)形成優(yōu)勢(shì)菌，所以沒(méi)有挑取到相應(yīng)菌落。純培養(yǎng)方法與PacBio SMRT測(cè)序檢測(cè)方法檢測(cè)出Lactobacillus plantarum含量差異較大，分別為32.69%和0.04%，出現(xiàn)此差異的原因可能在于兩份樣品中Lactobacillus plantarum活菌含量較高，導(dǎo)致在菌落隨機(jī)挑選過(guò)程中，增加了其挑取比例，Lactobacillus plantarum菌種挑選的太多，因此相對(duì)含量占比很大。

圖4 摩洛哥地區(qū)自然發(fā)酵橄欖汁中乳酸菌分離株豐富度比較Fig.4 The comparison of richness of lactic acid bacteria in natural fermented olive juice in Morocco

圖5 樣品中主要乳酸菌屬水平的相對(duì)含量分析Fig.5 The relative abundance of lactic acid bacteria in the sample based on genera level

圖6 樣品中主要乳酸菌種水平的相對(duì)含量分析Fig.6 The relative abundance of lactic acid bacteria in the sample based on species level

對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品的優(yōu)勢(shì)屬和優(yōu)勢(shì)種存在差異，純培養(yǎng)方法和PacBio SMRT 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分離出的優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus占比分別為46.15%和55.15%，而優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actococcus lactis，占比分別為42.31%和22.63%。觀察表2可以發(fā)現(xiàn)，純培養(yǎng)方法分離出的Lactobacillus和Lactococcus百分比含量差異并不大，分別為46.15%和42.31%。PacBio SMRT16S rRNA測(cè)序檢測(cè)方法在Lactobacillus中檢測(cè)出的菌種種類(lèi)很多，因此菌屬相對(duì)百分比含量很高，但在Lactococcus中檢測(cè)出的菌種只有Lactococcus lactis且含量占比很高，因此通過(guò)百分比含量來(lái)看，優(yōu)勢(shì)屬為L(zhǎng)actobacillus，優(yōu)勢(shì)種為L(zhǎng)actococcus lactis，但比較分析純培養(yǎng)方法和PacBio SMRT測(cè)序檢測(cè)方法分離出的菌株可以看出，在摩洛哥地區(qū)采集的發(fā)酵橄欖汁樣品中乳桿菌屬具有菌種多樣性，而乳球菌屬菌種比較單一。

表2 發(fā)酵橄欖汁中不同方法獲得的主要乳酸菌種屬含量比較Table 2 Comparison of main lactic acid bacteria species content obtained by different methods in fermenting olive juice

3 討論

在本研究中，采用純培養(yǎng)方法與PacBio SMRT 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)摩洛哥地區(qū)采集的發(fā)酵橄欖汁樣品進(jìn)行了細(xì)菌群落分析，早期純培養(yǎng)的出現(xiàn)主要是為了解決研究者在研究過(guò)程中面臨的多種微生物共存的復(fù)雜局面，目前我國(guó)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究仍然主要應(yīng)用微生物純培養(yǎng)技術(shù)[15]，但是純培養(yǎng)技術(shù)存在人為挑選誤差而導(dǎo)致菌種分離不全的情況，因此在對(duì)樣品研究時(shí)結(jié)合宏基因組PacBio SMRT 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)可以更完整地研究樣品中的菌種多樣性。

在本文中利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)和PacBio SMRT 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)主要分離出的Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum和Lactobacillus casei(paracasei)廣泛存在于各類(lèi)發(fā)酵食品中。例如在傳統(tǒng)乳制品、發(fā)酵蔬菜汁、酸菜、馬奶酒、發(fā)酵泡梨、發(fā)酵肉制品、酸奶等都分離出植物乳桿菌[16]。丁馮玲等[17]對(duì)12份云南泡梨樣品進(jìn)行菌種分離與鑒定，鑒 定 出79株Lactobacillus plantarum、3株Lactobacillus casei(paracasei)，Lactobacillus plantarum為發(fā)酵泡梨中的優(yōu)勢(shì)菌；高璇等[18]在新疆酸馬奶中共分離鑒定出20株對(duì)萬(wàn)古霉素具有耐受性的乳桿菌，其中L.plantarum為優(yōu)勢(shì)種。Lactobacillus casei(paracasei)是摩洛哥自然發(fā)酵制品中純培養(yǎng)得到的優(yōu)勢(shì)菌種之一。研究表明干酪乳桿菌可以提高宿主免疫力且具有顯著的益生效果[19]。本研究也分離到了腸球菌，腸球菌的存在主要有兩個(gè)方面的原因。首先，腸球菌是植物源食品中的常見(jiàn)乳酸菌分離株；其次，橄欖汁為自然發(fā)酵生產(chǎn)，可能存在發(fā)酵過(guò)程中污染的問(wèn)題。隨著消費(fèi)者對(duì)橄欖制品的青睞，橄欖制品中豐富乳酸菌資源的潛在益生功能和其他特性將會(huì)被進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本文運(yùn)用傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離鑒定方法從摩洛哥卡薩布蘭卡地區(qū)采集的自然發(fā)酵橄欖汁樣品中共分出52株菌株，鑒定為3個(gè)屬，4個(gè)種，其中Lactococcus lactis為優(yōu)勢(shì)菌種，占總分離株的42.31%。應(yīng)用三代測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品宏基因組測(cè)序分析，檢測(cè)到5個(gè)門(mén)、40個(gè)屬、80個(gè)細(xì)菌種，其中包括Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei(paracasei)等乳酸菌菌種，Lactococcus lactis為優(yōu)勢(shì)菌種，占總分離株的22.63%。本研究獲得了自然發(fā)酵橄欖汁中的乳酸菌資源，為優(yōu)良乳酸菌的開(kāi)發(fā)利用提供了寶貴的菌株。通過(guò)兩種方法全面地了解摩洛哥地區(qū)自然發(fā)酵橄欖汁制品中豐富的乳酸菌組成及豐度。此研究結(jié)果不僅可以豐富乳酸菌的菌種資源，可以為后期自然發(fā)酵食品中乳酸菌的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。