楊波若,李華健,蘇婭寧,李 霞,瞿 靜,陳 韜
(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明650201)
持水性(water-holding capacity,WHC)是肉類生產(chǎn)行業(yè)和消費(fèi)者共同關(guān)注的問題,常用汁液流失率高低(drip loss)衡量持水性[1-2]。汁液流失率的大小不僅受pH影響,也受鈣激活酶(calpains)活性[3]和關(guān)鍵細(xì)胞骨架蛋白降解程度的影響[4]。
研究表明,宰后豬肉的pH下降會(huì)抑制μ-calpain的自溶和骨架蛋白降解[5],從而導(dǎo)致較高的汁液流失[3]。μ-calpain是肌肉向食用肉轉(zhuǎn)化過程中重要的鈣激活酶,宰后μ-calpain被激活,其80 kDa亞基經(jīng)78 kDa亞基形式降解為76 kDa的亞基[6]。常用76 kDa亞基表達(dá)量來衡量μ-calpain的活性,76 kDa亞基的表達(dá)量越高,酶的自溶程度和活性越高[7],降解關(guān)鍵骨架蛋白——肌間線蛋白(desmin)的能力就越強(qiáng)。desmin纏繞在肌原纖維的Z盤上并與肌細(xì)胞膜直接相連,是維持肌纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有序性和肌細(xì)胞穩(wěn)定性的重要骨架蛋白[8]。整聯(lián)蛋白(integrin)是橫貫于細(xì)胞膜內(nèi)外的粘附性蛋白[9],在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜與細(xì)胞體彼此附著中起關(guān)鍵作用[10-11]。有報(bào)道顯示,宰后肌肉中μ-calpain活性[6]、desmin和integrin的表達(dá)量均會(huì)影響持水性[12]。Bee等[5]觀察到μ-calpain 80、78 kDa的亞基表達(dá)量均與汁液流失率呈顯著正相關(guān),76 kDa與汁液流失呈顯著負(fù)相關(guān),而張冬怡[13]等報(bào)道78 kDa亞基的表達(dá)量與汁液流失率呈顯著負(fù)相關(guān),80、76 kDa亞基表達(dá)量與汁液流失無顯著性相關(guān)。Zuo等[14]發(fā)現(xiàn)牦牛宰后高汁液流失組中desmin表達(dá)量顯著高于低汁液流失組,Zhang等[15]在鵝肉中也發(fā)現(xiàn)desmin降解有利于提高持水性,但Schafer等[16]認(rèn)為desmin的降解與汁液流失率無關(guān)。Qian等[17]在觀察豬肉持水能力實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)integrin降解量大持水能力高。但Lawson[12]認(rèn)為高汁液流失組中,integrin降解量大??梢?,μcalpain、desmin和integrin與持水性的關(guān)系還存在爭議。目前,國內(nèi)外學(xué)者[18-19]主要通過相關(guān)性分析來解釋pH、μ-calpain及骨架蛋白等自變量與持水性的關(guān)系,并不能完全反映出各變量對(duì)持水性的相對(duì)重要性。
偏最小二乘回歸分析(Partial least squares regression analysis,PLSR)可排除不顯著變量,篩選出對(duì)因變量解釋能力強(qiáng)的自變量[20]。因此,本研究運(yùn)用PLSR和相關(guān)性分析對(duì)μ-calpain、desmin、integrin和pH變化與持水性之間的關(guān)系進(jìn)行分析,為宰后肉類汁液流失率變化提供一定的理論依據(jù)。
豬肉樣品 在曲靖市東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)食品有限公司屠宰場選取同一批次平均體重在105 kg左右的三元雜交商品肉豬(大河烏豬×夏約克×長白豬),依照生豬屠宰規(guī)范(GB/T17236-2008)進(jìn)行宰殺。取右側(cè)第七腰椎段至最后腰椎段背最長肌用塑封袋包裹。依據(jù)背最長肌45 min時(shí)的pH和肉色,分別選取疑似蒼白發(fā)軟表面有汁液滲出的肉(Pale,soft exudative,PSE)樣品和正常肉的樣品各10條,依次編號(hào),放置于4 ℃恒溫冷庫內(nèi),分別于各時(shí)間點(diǎn)(45 min,3、9、12、24 h)測定pH和溫度。將各時(shí)間點(diǎn)樣品存于-30 ℃冷凍庫保存,后轉(zhuǎn)移置實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中凍藏保存,用于Western blotting蛋白定量分析;脫脂奶粉 武漢博士德生物;牛血清蛋白 分析純,北京索萊寶科技術(shù)公司;十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecylsulfonate,SDS)(分析純)、甘油(分析純)、吐溫-20(分 析 純)、N',N',N',N'-四 甲 基 乙 二 胺(N',N',N',N'-tetramethylethylenediamine,TEMED)(分析純)、β-巰基乙醇(分析純)、N',N'-雙-亞甲叉雙丙烯酰胺(超級(jí)純)、乙二胺四乙酸(分析純)、丙烯酰胺(超級(jí)純) Amresco公司;超特敏發(fā)光試劑盒碧云天生物有限公司;0.45 μm疏水性轉(zhuǎn)印膜(poly vinylidene fluoride,PVDF)、desmin一 抗(Antidesmin,No.MAB3430)、integrin一抗(Anti-integrin β1D, No.MAB1900)、二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L) Antibody, No.AP181P) Millpore公司;μcalpain一抗(Anti-μ-calpain,No.MA3940) Thermo Scientific公司。
CR-10Plus便攜式色差儀 美能達(dá);Bio Rad Power通用垂直電泳儀電源、轉(zhuǎn)印槽、ChemiDoc化學(xué)成像儀系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;HI9025C便攜式pH計(jì) 意大利哈他;HBMB-96PLUS紫外光酶標(biāo)儀 北京北方浩博科學(xué)儀器有限公司。
1.2.1 pH、肉色及汁液流率的測定 在4 ℃的冷藏環(huán)境中,將矯正好的便攜式pH計(jì)探頭插入待檢測樣品的內(nèi)部,測定宰后45 min,3、9、12和24 h的背最長肌的pH。將肉片平攤于干凈的桌面,用色差儀測定宰后45 min和24 h亮度值L*、紅度值a*和黃度值b*。
參照Honikel等[21]的方法測定汁液流失,具體操作如下:將準(zhǔn)備好的樣品切成2.5 cm厚的肉片,用精度為萬分之一的天平稱重,記做W1,稱重后用細(xì)鐵絲穿過肉片進(jìn)行固定,使肌纖維始終保持垂直向下,放置在清潔干燥的聚乙烯薄膜袋中(肉片與袋壁要保持距離,不能接觸袋壁),扎緊袋口后吊掛于4 ℃冷庫中,24 h后取出肉片再次稱重,記做W2,依據(jù)公式計(jì)算汁液流失率。
1.2.2 肌肉中μ-calpain、desmin和integrin表達(dá)量測定 全肌肉蛋白提取:參照Lonergan等[22]的方法,稱取切成碎末狀的樣品0.8 g,將其置于裝有10 mL磷酸鈉全肌肉蛋白提取液(2% (w/v) SDS;pH7.0)的離心管內(nèi)進(jìn)行15 s的低溫勻漿(6500 r/min)后室溫離心20 min取上清液并用酶標(biāo)儀測定濃度。使用雙蒸水將所有樣品測得蛋白濃度,統(tǒng)一調(diào)至6.4 mg/mL。將調(diào)整好濃度的樣品、上樣緩沖液(25 mmol/L Tris-HC1,3 mmol/L 乙二胺四乙酸,3% (w/v) SDS,30%(v/v) 甘油,0.001% (w/v) 溴酚藍(lán),pH8.0)和β-巰基乙醇按體積比10∶5∶1混合得到全肌肉蛋白溶液。用50 ℃水浴鍋將全肌肉蛋白溶液加熱20 min至變性,待冷卻至室溫將其分裝凍存于-80 ℃冰箱中備用。
SDS-PAGE凝膠制備:參照Zhao[3]等的方法并做修改。μ-calpain使用8%的分離膠(丙烯酰胺:N',N'-雙交叉甲基丙烯酰胺=1∶100, 1% (w/v) SDS,0.1% (v/v) TEMED,0.05% (w/v) APS) 和125 mmol/L Tris·HCl,pH8.8。desmin和integrin均使用10%的分離膠(丙烯酰胺:N,N'-雙交叉甲基丙烯酰胺=1∶100,1% (w/v) SDS,0.1% (v/v) TEMED,0.05% (w/v) APS和500 mmol/L Tris· HCl pH8.8)。μ-calpain、desmin和integrin濃縮膠統(tǒng)一使用5%的濃縮凝膠(丙烯酰胺:N',N'-雙-亞甲基丙烯酰胺=100∶1,1% (w/v) SDS,0.1% (v/v) TEMED,0.1% (w/v) APS和 0.125 mmol/L Tris·HCl pH6.8)。凝膠完成后,用保鮮膜包裹存放于4 ℃冰箱備用。
電泳及轉(zhuǎn)膜:將固定好凝膠板放入電泳緩沖液,從左至右依次向泳道加入預(yù)染蛋白Marker 7.5 μL、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)蛋白(選取本次實(shí)驗(yàn)宰后45 min,L組汁液流失率最低的樣品制備)和不同樣品在各時(shí)間點(diǎn)(依次為宰后45 min,3、9、12、24 h)的全肌肉蛋白樣品。μ-calpain和desmin的 上 樣 量 均 為80 μg,integrin為120 μg。設(shè)定濃縮電壓60 V,50 min,分離電壓100 V,1.5 h,進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法在200 mA下進(jìn)行為時(shí)1.5 h的轉(zhuǎn)膜操作,全程在冰浴中進(jìn)行。
Western blotting:轉(zhuǎn)印完成后,將轉(zhuǎn)印膜放置在用TBST溶液(25 mmol / L Tris pH7.0,0.1%(w/v)吐溫-20,80 mmol / L NaCl)配制的5%的脫脂奶粉封閉液中,室溫封閉2 h。將封閉好的蛋白膜分別置于對(duì)應(yīng)的一抗(用含3%牛血清白蛋白的TBST稀釋)中4 ℃孵育過夜。一抗孵育過夜后,將蛋白膜置于TBST沖洗3×10 min,洗去未結(jié)合的抗體,后轉(zhuǎn)至二抗(用含3%牛血清白蛋白的TBST稀釋)中室溫孵育2 h。二抗孵育完成,后用TBST沖洗3×10 min,洗去未結(jié)合的抗體,完成后將膜放置在ECL化學(xué)發(fā)光試劑下顯影并在凝膠成像系統(tǒng)掃描(BIO RAD Chemical XRS++)中曝光,得到蛋白灰度值圖片。用Image J圖像分析軟件測定樣品各個(gè)時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)蛋白的灰度值,按照Bee等[5]的方法用各個(gè)時(shí)間的相對(duì)灰度值比上標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的灰度值,得到目標(biāo)蛋白的相對(duì)灰度值,用目標(biāo)蛋白的相對(duì)灰度值來表示肌肉中目標(biāo)蛋白表達(dá)量。其中,μ-calpain的一抗釋比例為1∶2000;desmin的一抗釋比例為1∶1000;integrin的一抗釋比例為1∶800。μ-calpain和desmin的二抗釋比例均為1∶5000,integrin的二抗釋比例為1∶8000。
采用SPSS 23.0進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析、平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤計(jì)算、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素ANOVA分析和多重比較。由于宰后各時(shí)間點(diǎn)的pH不成正態(tài)分布,因此與pH有關(guān)的相關(guān)性分析均采用Spearman相關(guān)系分析[23]。鑒于PLSR適用于樣本量小且變量可以不符合正太分布的數(shù)據(jù)[24-25],故使用Unscrambler 10.4軟件進(jìn)行PLS1回歸分析。使用Microsoft office 2019和Origin 2018進(jìn)行圖片及表格繪制。
依據(jù)宰后24 h的汁液流失率高低,對(duì)樣品進(jìn)行聚類,當(dāng)歐氏距離增至10時(shí),可以將樣品分為高汁液流失組(High drip loss;H組,drip loss ≥ 5.01%,n=10)和低汁液流失組(Low drip loss;L組,drip loss ≤4.00%,n=10)(圖1)。H組平均汁液流失率是L組的2.625倍(表1),極顯著高于L組(P<0.01)。H組宰后45 min的L*極顯著高于L組(P<0.01),但兩組間的L*、a*、b*值在宰后24 h時(shí)均無顯著差異(P>0.05)。
圖1 宰后24 h樣品的汁液流失率聚類分析的樹狀圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for drip loss of samples at 24 h post-mortem
表1 高低汁液流失率組肉樣的肉質(zhì)指標(biāo)Table 1 Meat quality index of L-group and H-group
圖2為 宰 后μ-calpain、desmin和integrin的Western blot的條帶圖。由圖2A可以看出宰后各時(shí)間點(diǎn)H組的desmin蛋白條帶均比L組粗、顏色深;在45 min~12 h時(shí),H組的desmin蛋白條帶隨著宰后時(shí)間的增加幾乎沒有變化,在24 h時(shí)出現(xiàn)明顯降解,而L組的desmin條帶隨著宰后時(shí)間的延長而逐漸變淺變細(xì)。如圖2B所示,在宰后各時(shí)間點(diǎn),L組的integrin蛋白條帶明顯比H組粗、顏色深,且H組和L組的integrin條帶均會(huì)隨著宰后時(shí)間的延長逐漸變淺、變小。μ-calpain的Western blot蛋白條帶如圖2C所示,宰后各時(shí)間點(diǎn)H組的80 kDa和78 kDa亞基比L組條帶顏色深,76 kDa條帶比L組顏色淺。
圖2 骨架蛋白Western blot結(jié)果Fig.2 Western blot results of cytoskeleton protein
如圖3A所示,宰后45 min~12 h, 兩組的pH均呈直線下降,12~24 h有所回升。宰后45 min~12 h時(shí)H組的pH都顯著低于L組(P<0.05),表明汁液流失率高的樣品pH低。隨時(shí)間延長,desmin和integrin出現(xiàn)不同程度的降解。由圖3B所示,相對(duì)于宰后9 h,H組desmin在宰后24 h出現(xiàn)顯著降解(P<0.05)但L組在12 h就出現(xiàn)顯著降解(P<0.05)。3~24 h時(shí)H組desmin的表達(dá)量顯著高于L組(P<0.05),說明在desmin表達(dá)量大的組內(nèi)汁液流失率高,持水性差;45 min、3 h和24 h時(shí)H組integrin的表達(dá)量顯著低于L組(P<0.05)(圖3C),表明L組細(xì)胞內(nèi)integrin表達(dá)量大,肌肉汁液流失率低,持水能力強(qiáng)。宰后μ-calpain發(fā)生自溶,其80 kDa的亞基經(jīng)78 kDa亞基形式降解為76 kDa,76 kDa亞基表達(dá)量越高,μ-calpain的活性就越高。如圖3的D、E、F所示,宰后各時(shí)間點(diǎn),兩組的80 kDa亞基表達(dá)量差異不顯著(P>0.05);45 min時(shí)H組78 kDa亞基表達(dá)量顯著大于L組(P<0.05);12~24 h時(shí),L組的76 kDa亞基表達(dá)量極顯著大于H組(P<0.01);由此可知宰后12 h和24 h時(shí)H組的μcalpain活性低于L組。
如表2所示,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),desmin的表達(dá)量與pH呈負(fù)相關(guān)但不顯著(P>0.05)。integrin與pH整體呈正相關(guān),其中在45 min時(shí)integrin的表達(dá)量與宰后9 h和12 h的pH呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);在12 h時(shí),與宰后9 h和24 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05);在24 h時(shí),與宰后9 h和12 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。μ-calpain80、78 kDa亞基的表達(dá)量與pH整體呈負(fù)相關(guān),而76 kDa與之相反。在45 min時(shí)μ-calpain 76 kDa亞基的表達(dá)量與宰后9 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05);在3 h時(shí),與宰后12 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05);在9 h時(shí),與宰后12 h的pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。μ-calpain 76 kDa亞基表達(dá)量越高,μcalpain的活性就越高。因μ-calpain76 kDa表達(dá)量整體與pH呈正相關(guān),故μ-calpain活性整體與pH呈正相關(guān)。
宰后汁液流失率與24 h時(shí)desmin的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與45 min、12 h和24 h時(shí)的integrin表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與9 h時(shí)μ-calpain 80 kDa亞基表達(dá)量、45 min和12 h時(shí)μcalpain 78 kDa亞基表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與45 min和9 h時(shí)μ-calpain 76 kDa亞基表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。表明宰后肌肉內(nèi)desmin表達(dá)量越多,汁液流失率越高;integrin的表達(dá)量越高,汁液流失率越低;μ-calpain76 kDa亞基表達(dá)量越高,μcalpain活性越高,汁液流失率越低。
通過建立PLS1回歸模型,分析μ-calpain、desmin、integrin和pH變化對(duì)汁液流失率的影響。如圖4所示,汁液流失率與宰后各時(shí)間點(diǎn)的pH呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);與45 min、3 h和12 h的integrin表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);與24 h的desmin表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05);與45 min~12 h的μ-calpain 80 kDa、45 min的μ-calpain 78 kDa亞基的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);與45 min的76 kDa亞基呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)。說明宰后低pH會(huì)導(dǎo)致較高的汁液流失率;肌肉中desmin表達(dá)量越多,汁液流失率越高,與之相反的是與肌肉中integrin和μ-calpain 76 kDa亞基(μ-calpain活性)的表達(dá)量越高,汁液流失率越低。
圖3 宰后不同汁液流失組pH(A)、desmin(B)、integrin(C)、μ-calpain 80 kDa(D)、78 kDa(E)、76kDa(F)的表達(dá)量變化Fig.3 Changes in pH (A),desmin (B),integrin (C) and μ-calpain 80 kDa (D), 78 kDa (E), 76 kDa (F) expression levels in different drip loss groups post-mortem
表2 μ-calpain、desmin和integrin與pH和汁液流失率的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of μ-calpain, desmin and integrin with pH and drip loss
續(xù)表2
圖4 pH、desmin(D)、integrin(I)、μ-calpain 80 kDa(80 k)、μ-calpain 78 kDa(78 k)、μ-calpain 76 kDa(76 k)與汁液流失率的PLS1模型分析Fig.4 PLS1 model of explained variance for drip loss by pH,desmin (D),integrin (I),μ-calpain 80 kDa (80 k),μ-calpain 78 kDa (78 k), μ-calpain76 kDa(76 k)
表3為宰后μ-calpain、demsin、integrin和pH的變化對(duì)汁液流失率解釋能力的PLS1模型。結(jié)果顯示:pH作為單變量時(shí)對(duì)汁液流失的解釋能力最強(qiáng),主要受宰后3 h的pH控制,解釋了78.1%的汁液流失變異;μ-calpain、desmin和integrin的表達(dá)量分別解釋了42.4%、70.3%和71.7%的汁液流失變異。為明確宰后μ-calpain、desmin和integrin三者共同對(duì)汁液流失率的影響,將這三個(gè)自變量與汁液流失率構(gòu)建PLS1回歸模型(見表3中模型5),該模型主要由宰后9 h和24 h時(shí)的desmin和45 min、12 h和24 h 時(shí)integrin的表達(dá)量控制,解釋了88.1%的汁液流失變異率。隨后排除不顯著變量得到模型6,該模型主要受宰后45 min的desmin和integrin的表達(dá)量控制。與模型5相比,模型6的解釋能力下降了7.2%說明宰后12 h的μ-calpain76 kDa表達(dá)量對(duì)汁液流失的影響也十分重要。
宰后45 min~12 h,H組樣品的pH顯著低于L組(P<0.05)(圖3A)且與汁液流失呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表2),說明pH越低,汁液流失越高,持水性越差,這與Bowker[26]等的報(bào)道一致。同時(shí)PLS1模型顯示pH的變化解釋了汁液流失變異的78.1%,進(jìn)一步證實(shí)pH是影響豬肉汁液流失率的關(guān)鍵因素。
宰后H組的desmin(3~24 h)表達(dá)量高于低L組(P<0.05),μ-calpain的活性(12 h和24 h)和pH(45 min~12 h)顯 著 低 于L組(P<0.05),且desmin的表達(dá)量與汁液流失呈正相關(guān)(P<0.05),pH與μ-calpain活性呈正相關(guān)(P<0.05)。這表明宰后H組的低pH抑制了μ-calpain活性,使μ-calpain對(duì)desmin的降解能力減弱[27]。僵直期,大量的desmin可以使肌原纖維橫向收縮的力傳遞至整個(gè)肌細(xì)胞,導(dǎo)致肌細(xì)胞橫向收縮,使肌細(xì)胞間間隙增加,導(dǎo)致高汁液流失[28]。H組的integrin(45 min、3 h和24 h)表達(dá)量低于L組(P<0.05),且integrin的表達(dá)量與pH呈正相關(guān),與汁液流失率呈負(fù)相關(guān)。這可能是因?yàn)樵缀筝^低的pH會(huì)促使integrin發(fā)生降解,從而導(dǎo)致高汁液流失[6]。如果細(xì)胞內(nèi)integrin大量降解則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的黏附結(jié)構(gòu)被破壞[29],細(xì)胞膜剝離細(xì)胞體,在細(xì)胞膜與細(xì)胞體之間形成間隙,造成汁液流失[12]。從μ-calpain、desmin和integrin與汁液流失的PLS1模型(表3模型5)中發(fā)現(xiàn),宰后汁液流失率主要受到宰后μ-calpain76 kDa12h、desmin9h+24h和integrin45min+12h+24h的表達(dá)量控制,這可能是因?yàn)樵缀螃?calpain活性低,降解desmin的能力低,細(xì)胞內(nèi)desmin表達(dá)量高可能在細(xì)胞間形成較大的間隙,促使汁液流失形成;完整的integrin在維持細(xì)胞膜黏附結(jié)構(gòu)完整性上起重要作用,如果integrin的表達(dá)量低,細(xì)胞膜與細(xì)胞體之間就形成間隙且汁液流失增加。
表3 測量參數(shù)(μ-calpain76 kDa、pH、desmin、integrin)(X-變量)對(duì)汁液流失率(Y-變量)解釋能力的PLS1模型Table 3 PLS1 models of explained variance for drip loss (Y-variable) by the measurement traits(μ-calpain76 kDa, pH, desmin, integrin) (X-variable)
宰后pH變化可能通過影響μ-calpain活性、desmin和integrin的表達(dá)量,從而對(duì)汁液流失產(chǎn)生影響。宰后肌細(xì)胞內(nèi)的demsin表達(dá)量高可能在細(xì)胞間形成較大的間隙,促使高汁液流失形成;integrin表達(dá)量低可能在細(xì)胞膜與細(xì)胞體之間形成較大的間隙,造成更高的汁液流失。鑒于本次實(shí)驗(yàn)只觀測到宰后24 h內(nèi)的變化,24 h后的變化需要進(jìn)一步研究。