基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)前列腺癌預(yù)后相關(guān)mRNA風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建

張漢榮，林聯(lián)拯，趙 力，于忠英，李金雨

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院（廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院）泌尿外科，福建 漳州363000）

0 引言

前列腺癌是一種常見(jiàn)而復(fù)雜的惡性腫瘤，根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球每年約有130萬(wàn)例前列腺癌新發(fā)病例，死亡病例達(dá)36萬(wàn)例，占所有腫瘤新發(fā)病例的15%，是男性第二常見(jiàn)的腫瘤類型和第五大癌癥死亡原因［1-2］.目前，前列腺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放療、化療和激素治療［3-4］.選擇何種治療手段與腫瘤的分期、分級(jí)及危險(xiǎn)度等因素密切相關(guān)［5］.前列腺癌的預(yù)后模型的構(gòu)建、或利用構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型指導(dǎo)前列腺癌患者分層治療是前列腺癌的研究熱點(diǎn)之一.目前的預(yù)測(cè)模型大多數(shù)是以患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期等臨床資料為影響因素，預(yù)測(cè)模型的效率和精度上仍存在不足［6-8］.隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，利用癌癥基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建的癌癥預(yù)后模型顯示出良好的預(yù)測(cè)性能［9-10］.本研究的目的是，利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA中提供的前列腺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)，篩選潛在的前列腺癌相關(guān)基因，并利用這些候選基因構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，為臨床前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、分層治療提供參考依據(jù).

1. 資料與方法

1.1 研究資料

從the cancer genome atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.tcga.org/）下載前列腺癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床資料.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄前列腺癌癌組織492例，癌旁組織52例.

1.2 前列腺癌組與對(duì)應(yīng)癌旁組織差異基因的篩選與富集分析

根據(jù)TCGA下載的數(shù)據(jù)，利用R軟件的“edge”包篩選出癌組織與癌旁組織間差異表達(dá)的mRNA.篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|Log2FC|≥1，Padj≤0.05.利用Volcano Plot包對(duì)差異基因數(shù)據(jù)繪制火山圖.利用clusterProfiler包對(duì)前列腺癌組織的上調(diào)基因分別進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析，以了解前列腺癌與癌旁組織差異基因的基因功能和信號(hào)通路的富集情況.

1.3 差異基因?qū)η傲邢侔┗颊哳A(yù)后的影響

以上調(diào)最明顯的10個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因，分別以上述基因mRNA表達(dá)量中值為分界線，將492例前列腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并做生存分析.比較差異基因?qū)η傲邢侔╊A(yù)后的影響.生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

1.4 COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的構(gòu)建

將上述生存分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因納入COX回歸分析，以各基因的表達(dá)量為自變量，患者的生存時(shí)間為因變量.COX回歸模型計(jì)算各患者的風(fēng)險(xiǎn)得分（Risk score），最后根據(jù)患者的風(fēng)險(xiǎn)得分將492例患者分為高危組和低危組，進(jìn)一步進(jìn)行生存分析，比較高危組和低危組的生存差異.ROC曲線用于驗(yàn)證該風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測(cè)精度.

2. 結(jié)果

2.1 前列腺癌對(duì)應(yīng)癌旁組織的差異基因及富集分析

基因表達(dá)差異分析結(jié)果如圖1A所示，共篩選表達(dá)上調(diào)基因1978個(gè)，下調(diào)基因1644個(gè).其中，上調(diào)最明顯的基因?yàn)椋篜CA3、AMACR、MTND4P12、RNY3P8、DLX1、OR51E2、PCAT14、GOLM1、HPN、GLYATL1.下調(diào)最明顯的基因?yàn)椋篈DAM33、MEG3、GSTM2、GABRE、CYP3A5、CORO6、GOLGA8A、DIO3OS、SLC26A10、HIF3A.

對(duì)上調(diào)基因做GO功能富集分析，結(jié)果如圖1B所示，上調(diào)的基因主要與carboxylic acid biosynthetic process，organic acid biosynthetic process及sulfur compound metabolic process等代謝過(guò)程有關(guān).KEGG富集分析（圖1C）顯示，上調(diào)基因主要集中在Phagosome、Cell adhesion molecules和Hematopopoietic aureus infection等信號(hào)通路.

圖1 差異基因火山圖及GO功能、KEGG通路富集分析結(jié)果

2.2 差異基因?qū)η傲邢侔┗颊哳A(yù)后的影響

上調(diào)最明顯的10個(gè)基因?qū)︻A(yù)后的影響分別如圖2所示，生存分析有顯著差異的基因有6個(gè)，分別為PCA3、MTND4P12、RNY3P8、OR51E2、PCAT14、GOLM1.且上述基因的生存分析中，均表現(xiàn)為低表達(dá)組的總生存率較高表達(dá)組高.因此，考慮上述6個(gè)基因可能是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因.

圖2 10個(gè)差異基因?qū)?92例前列腺癌患者預(yù)后的影響

2.3 COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的構(gòu)建

以各基因的表達(dá)量為自變量，生存時(shí)間為因變量，得到風(fēng)險(xiǎn)得分公式為：Risk score=0.5503×（PCA3）+0.6777×（MTND4P12）+0.5605×（RNY3P8）-0.365×（OR51E2）+0.5358×（PCAT14）-0.1972×（GOLM1）.計(jì)算492例前列腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)得分，并以風(fēng)險(xiǎn)得分的中值將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組與低分險(xiǎn)組（圖3A），該模型的ROC曲線（圖3B）曲線下面積為0.801，故認(rèn)為該模型的預(yù)測(cè)精度較好.高、低風(fēng)險(xiǎn)組的生存分析結(jié)果如圖3C所示，結(jié)果提示，高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存時(shí)間明顯較低風(fēng)險(xiǎn)組低，P＜0.0001.從高、低風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線可看出，多個(gè)基因表達(dá)水平構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型，較單一基因表達(dá)水平的生存分析差異更大，提示多基因表達(dá)構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型比單一基因構(gòu)建的模型預(yù)測(cè)精度更高.

圖3 COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的構(gòu)建

3. 討論

與其他腫瘤相比，前列腺癌具有更明顯的腫瘤異質(zhì)性，不同個(gè)體間的差異大［11］.良好的預(yù)后模型可以促進(jìn)臨床咨詢和指導(dǎo)醫(yī)生制定治療和隨訪計(jì)劃.目前臨床上用于評(píng)估前列腺癌患者預(yù)后的模型主要有前列腺特異抗原（PAS）水平，Gleason評(píng)分腫瘤臨床分期等［12-14］.然而，上述用于評(píng)估前列腺癌患者危險(xiǎn)度的模型的精確度仍不能滿足準(zhǔn)確的患者分類和分層的需求.因此，臨床上亟需一種可精確預(yù)測(cè)患者危險(xiǎn)度的預(yù)測(cè)模型，以指導(dǎo)前列腺癌患者的指導(dǎo)治療，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療.目前已有大量基因單個(gè)基因表達(dá)量構(gòu)建的前列腺癌預(yù)后模型，如Mee YK等［15］的研究提示，高表達(dá)FOXM1基因與前列腺癌預(yù)后差相關(guān).除FOXM1基因外，近年來(lái)，ARHGAP10［16］，SNW1［17］，NCAPH［18］等基因也有類似報(bào)道.但是基于單基因構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)效能及模型的穩(wěn)定性相對(duì)較差.L Schmidt等［19］通過(guò)對(duì)接受根治性前列腺切除術(shù)的123名男性的前列腺癌組織樣本進(jìn)行全基因組miRNA表達(dá)譜分析，篩選出6個(gè)與前列腺癌預(yù)后最相關(guān)的miRNA，并利用其中的4個(gè)miRNA的表達(dá)量比值構(gòu)建預(yù)測(cè)模型.結(jié)果顯示該預(yù)測(cè)模型對(duì)前列腺癌具有良好的預(yù)測(cè)作用.

本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的492例前列腺癌組織和52例癌旁組織的全基因組測(cè)序結(jié)果分析，篩選出在癌組織中高表達(dá)的基因.以上調(diào)最明顯的10個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因，分別以各基因的表達(dá)水平中值為界，比較高表達(dá)組與低表達(dá)組間患者預(yù)后的差異.結(jié)果提示，10個(gè)候選基因，有6個(gè)（PCA3、MTND4P12、RNY3P8、OR51E2、PCAT14、GOLM1）基因的表達(dá)量與預(yù)后相關(guān)，均表現(xiàn)為高表達(dá)提示預(yù)后不良.進(jìn)一步對(duì)聯(lián)合上述6個(gè)基因做COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型.以上述6個(gè)基因的表達(dá)量為自變量，患者生存資料為因變量.結(jié)果提示，聯(lián)合6個(gè)基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型具有良好的預(yù)測(cè)精度（AUC=0.801）.根據(jù)模型可利用各患者上述6個(gè)基因的表達(dá)量計(jì)算該患者的風(fēng)險(xiǎn)得分.本研究進(jìn)一步將492例患者風(fēng)險(xiǎn)得分的中值為分界線，比較高、低分險(xiǎn)組生存差異.結(jié)果提示，高風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間明顯較低風(fēng)險(xiǎn)組短（P＜0.00001）.聯(lián)合6個(gè)基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型做的生存分析的P值明顯小于單一基因生存分析的P值，提示，該風(fēng)險(xiǎn)模型具有更好的預(yù)測(cè)精度.

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法，成功構(gòu)建了一個(gè)以6基因（PCA3、MTND4P12、RNY3P8、OR51E2、PCAT14、GOLM1）mRNA表達(dá)水平為自變量的風(fēng)險(xiǎn)模型.該模型顯示出良好的預(yù)測(cè)精度.