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    頤腦解郁方對(duì)血管性癡呆大鼠模型甲狀腺軸功能的影響

    2021-06-24 00:25:58寇娜郝鈺趙瑞珍趙子珺唐啟盛
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年6期
    關(guān)鍵詞:下丘腦灌胃變性

    寇娜 郝鈺 趙瑞珍 趙子珺 唐啟盛

    血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由缺血性卒中等原因所致的認(rèn)知功能障礙綜合征,是繼阿爾茨海默病后第二大癡呆類型,約占所有癡呆類型的20%[1-2]。多項(xiàng)臨床研究表明VD患者可能合并甲狀腺激素水平的變化,且低甲狀腺激素可進(jìn)一步加速VD患者認(rèn)知功能障礙[3-6]。VD患者多表現(xiàn)為思維遲滯、不寐、乏力、腰膝酸軟、胸脅脹滿、面色晦暗、舌淡或暗、苔白、脈沉細(xì)或沉弦,中醫(yī)辨證多屬腎虛肝郁證型。先前的研究表明頤腦解郁方能夠改善腎虛肝郁型VD大鼠的認(rèn)知功能,但是否與調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平相關(guān)少有報(bào)道[7]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察VD大鼠下丘腦—垂體—甲狀腺軸(hypothalamus pituitary thyroid axis,HPT)相關(guān)因子的變化,探討頤腦解郁方是否通過調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平來改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(6周齡,體質(zhì)量200~220 g)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供動(dòng)物許可證:SCXK(京)2016-0006。大鼠適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)1周,自由攝食和飲水,動(dòng)物房室溫22~25℃,相對(duì)濕度55%~65%,光照周期晝夜各12小時(shí)。

    1.2 動(dòng)物模型建立及分組

    大鼠VD模型參考Longa等[8]報(bào)道的線栓造模方法,手術(shù)過程中室內(nèi)溫度保持27~30℃,并采用數(shù)字量表評(píng)價(jià)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)神經(jīng)功能,選擇術(shù)后24小時(shí)評(píng)分為7~12分中度損傷大鼠,不予干預(yù)4周后自然癡呆經(jīng)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)篩選后選出[9]。

    實(shí)驗(yàn)將30只VD大鼠隨機(jī)分為VD模型組、VD中藥組,每組15只。15只假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎外,其余步驟完全與VD造模方法相同。正常組選取15只正常大鼠不予任何干預(yù)。其中VD中藥組大鼠灌胃中藥頤腦解郁方(大鼠灌胃劑量根據(jù)成人用量的7倍進(jìn)行計(jì)算,配成419 mg/kg混懸液,每日劑量為10 mL/kg,灌胃量根據(jù)每周大鼠的體質(zhì)量變化調(diào)整)。正常組、假手術(shù)組、VD模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),灌胃0.9%生理鹽水,每日劑量10 mL/kg,連續(xù)4周。動(dòng)物保健及使用經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)協(xié)議批準(zhǔn)。

    1.3 主要儀器和試劑

    二甲苯購于天津市進(jìn)豐化工有限公司;無水乙醇購于北京化工廠;促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone,TSH)放免試劑盒、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,F(xiàn)T3)放免試劑盒、游離甲狀腺素(free thyroxine,F(xiàn)T4)放免試劑盒由北京華英公司提供;戊巴比妥購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。Morris水迷宮設(shè)備由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供;DTT-2跳臺(tái)儀由中國科學(xué)研究院提供;生物組織包埋機(jī)(型號(hào)YD-6L)購于金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司;石蠟切片機(jī)(型號(hào)FINESSE 325)購于SHANDON公司;超純水儀(型號(hào)D7411)購于美國Barnstead公司;光學(xué)顯微鏡(型號(hào)BN-2)購于日本Olympus公司。圖片處理運(yùn)用NIS-Elements B R Version2.34及AMT Image Capture Engine圖片成像軟件完成。

    1.4 主要藥品

    頤腦解郁方(刺五加20 g、梔子10 g、五味子10 g、郁金10 g)購于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房,配方顆粒由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。灌胃劑量按照成人常用量(20 mg·60 kg-1·d-1)的7倍計(jì)算大鼠用量,濃度為0.62 g/mL,4℃冰箱冷藏備用,灌胃前加熱。

    1.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

    各組大鼠于灌胃1周與4周末次30分鐘后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。跳臺(tái)裝置為15 cm×30 cm×30 cm的被動(dòng)回避反應(yīng)箱,實(shí)驗(yàn)時(shí)先將大鼠放入箱中訓(xùn)練3分鐘,然后通36 V交流電,記錄每只大鼠第一次跳下安全區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和錯(cuò)誤次數(shù)。

    1.6 Morris水迷宮

    各組大鼠于灌胃1周與4周末次行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),記錄逃避潛伏期時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)。(1)定位航行試驗(yàn):將大鼠于第1象限入點(diǎn)處面向池壁放入水中,記錄大鼠在120秒內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期時(shí)間,之后分別從其他3個(gè)象限入水點(diǎn)將大鼠放入水中,連續(xù)訓(xùn)練5天。(2)空間探索試驗(yàn):于第6天撤去平臺(tái),在第1象限入點(diǎn)處將大鼠放入水中,記錄大鼠在60秒內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡,并計(jì)算其穿越平臺(tái)次數(shù)。

    1.7 下丘腦病理學(xué)觀察

    各組大鼠灌胃1周與4周末次,隨機(jī)選擇6只大鼠在行為學(xué)檢測后麻醉處死,斷頭取腦組織投入預(yù)先配好的固定液(4%多聚甲醛)使其蛋白質(zhì)變性凝固后,切取下丘腦部位進(jìn)行常規(guī)固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋,冠狀切片、再脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、常規(guī)脫水,透明,封片,觀察大鼠下丘腦病理學(xué)變化。

    1.8 HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4的含量

    各組大鼠灌胃4周末次,隨機(jī)選擇8只大鼠在行為學(xué)檢測后麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,4℃離心10分鐘取血清,并用全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀按試劑盒說明的放射免疫法測定血清TSH、FT3、FT4含量。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

    與正常組相比,假手術(shù)組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)均無明顯差異(P>0.05),VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時(shí)間顯著下降,錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與VD模型組相比,VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時(shí)間顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),錯(cuò)誤次數(shù)在灌胃1周后統(tǒng)計(jì)無顯著性差異(P>0.05),灌胃4周后顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

    表1 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響

    2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

    與正常組相比,假手術(shù)組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)無明顯差異(P>0.05),VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃4周逃避潛伏期時(shí)間明顯增多(P<0.05,P<0.01);VD模型組大鼠灌胃1周穿越平臺(tái)次數(shù)顯著下降(P<0.01),VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃4周穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯下降(P<0.05)。與VD模型組相比,VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時(shí)間減少,穿越平臺(tái)次數(shù)增多,但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表2、表3。

    表2 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響

    表3 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)的影響

    2.3 下丘腦病理學(xué)觀察

    光鏡顯示,正常組大鼠灌胃1周下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列有序,細(xì)胞核大,淡染,染色質(zhì)分布均勻,核仁清晰,未見變性、壞死等病變,且灌胃4周與1周相比未見差異。與正常組相比,假手術(shù)組大鼠下丘腦病理形態(tài)變化不明顯;VD模型組大鼠灌胃1周下丘腦見大片液化性壞死灶,呈篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),壞死區(qū)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死,小膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯及炎癥細(xì)胞浸潤,且大鼠灌胃4周較1周后下丘腦細(xì)胞變性、壞死程度更明顯。與VD模型組相比,VD中藥組大鼠灌胃1周下丘腦細(xì)胞變性程度減輕,但仍見大片液化性壞死灶,呈篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),壞死區(qū)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死,小膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯及炎癥細(xì)胞浸潤,且大鼠灌胃4周較1周下丘腦細(xì)胞變性減輕明顯(見圖1)。

    圖1 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠下丘腦形態(tài)的影響(HE,×400)

    2.4 HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4含量測定

    與正常組相比,假手術(shù)組大鼠血清FT3、FT4、TSH含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);VD模型組、VD中藥組大鼠血清FT3、FT4含量顯著下降(P<0.05,P<0.01),血清TSH含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與VD模型組相比,VD中藥組大鼠血清FT3、FT4含量明顯升高(P<0.05,P<0.01),血清TSH含量顯著下降(P<0.01)。結(jié)果見表4。

    表4 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4的影響

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)選擇改良版的線栓法造成大鼠腦血管性病變后4周不予任何干預(yù),待其自然癡呆的VD模型更好的模擬了現(xiàn)實(shí)生活中人腦血管病變后出現(xiàn)癡呆的病況,避免了一系列復(fù)雜因素的影響[10]。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是研究實(shí)驗(yàn)室嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶的常用方法[11]。本研究數(shù)據(jù)表明腦血管病變后隨著病程的延長,VD大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力也逐漸下降,導(dǎo)致認(rèn)知障礙,與臨床VD患者不同階段出現(xiàn)的反應(yīng)遲鈍、思維混亂、記憶模糊、智力障礙等癥狀表現(xiàn)類似[12]。

    HPT軸的功能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展和正常功能的維持有重要的作用。研究表明,VD認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能與海馬組織的病理性損傷相關(guān),而下丘腦是否損傷的報(bào)道研究甚少[13]。本研究通過HE染色技術(shù)觀察大鼠下丘腦的病理形態(tài),發(fā)現(xiàn)VD模型組大鼠下丘腦可見大片液化性壞死灶,小膠質(zhì)細(xì)胞增生,大量炎癥細(xì)胞浸潤。臨床研究表明,VD患者發(fā)生腦梗死病灶侵及基底節(jié)區(qū)等部位可引起HPT軸功能紊亂,垂體反應(yīng)性不佳致TSH分泌不足時(shí),甲狀腺激素的合成及外周代謝發(fā)生障礙,血清中FT3、FT4顯著降低,代償性刺激TSH的分泌[14-16]。本課題組通過放射免疫法檢測HPT軸相關(guān)激素水平發(fā)現(xiàn),VD可導(dǎo)致FT3、FT4的含量減少,TSH含量升高,與先前研究一致[17]。

    VD屬中醫(yī)學(xué)“呆病”“健忘”等范疇[18]。課題組認(rèn)為此病的病變部位在腦,多肝腎不足,中醫(yī)辨證多屬腎虛肝郁證型。頤腦解郁方由刺五加、郁金、梔子、五味子組成,方中刺五加、郁金二藥為君臣,兩者配伍既益氣補(bǔ)腎,填精益髓,又疏肝利膽,行氣解郁,腎氣足則腦髓漸充,肝氣達(dá)則郁氣自疏。梔子清解腦絡(luò)痰濁瘀毒,五味子澀精滋腎安神,又可防郁金、梔子苦寒清瀉過度,斂正氣而不斂邪氣,共為佐藥[19]。本課題組先前研究表明,頤腦解郁方可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)含量相關(guān)[20]。本次研究結(jié)果表明,頤腦解郁方可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,減輕下丘腦細(xì)胞變性、壞死程度,并能調(diào)節(jié)HPT軸的TSH、FT3、FT4含量。

    綜上所述,頤腦解郁方對(duì)VD認(rèn)知功能有改善作用,機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4含量有關(guān)。

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