超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分離和測定煙草烯酰嗎啉順反異構(gòu)體

楊 飛，紀(jì) 元，崔浩哲，王 穎，劉珊珊，鄧惠敏，范子彥，邊照陽，唐綱嶺，李中皓

1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6 號 450001

2.蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇省蘇州市高新區(qū)科銳路1 號 215009

3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

烯酰嗎啉是巴斯夫公司開發(fā)的一種新型內(nèi)吸治療性專用低毒殺菌劑［1］，其殺菌機(jī)制是通過破壞病菌細(xì)胞壁膜的形成，導(dǎo)致孢子囊壁的分解，從而使病菌死亡，主要用于預(yù)防和治療葡萄、西紅柿、煙草等農(nóng)作物的霜霉病及晚疫病等［2］。由于其分子結(jié)構(gòu)中含有C=C 雙鍵，烯酰嗎啉有兩個順反異構(gòu)體（圖1）。

盡管立體異構(gòu)體具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)，但卻表現(xiàn)出截然不同的生物活性、毒性和其他性質(zhì)［3-10］。如（Z）-辛硫磷對蚊蟲幼蟲的殺蟲活性比（E）-辛硫磷高約3 倍［11］。Piao 等［12］研究了3 種土壤中烯酰嗎啉的選擇性降解，結(jié)果表明，（E）-烯酰嗎啉的降解速度快于（Z）-烯酰嗎啉。Fan等［13］也研究了葡萄中烯酰嗎啉異構(gòu)體的殘留量和降解情況，發(fā)現(xiàn)（E）-烯酰嗎啉的降解速度快于（Z）-烯酰嗎啉。立體異構(gòu)體之間具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)，因此很難通過傳統(tǒng)分析技術(shù)加以分離。在大多數(shù)情況下，立體異構(gòu)體在常規(guī)分析中始終被視為一種化合物。非立體選擇性分析僅能提供部分信息，而這些信息不能為農(nóng)藥的風(fēng)險評估提供完整而可靠的數(shù)據(jù)。CORESTA 農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會制定的農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量表中，烯酰嗎啉［（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉之和］的殘留限量被定為2 mg/kg。由于立體異構(gòu)體農(nóng)藥難以分離和純化，因此市場上銷售的大部分農(nóng)藥均是不同異構(gòu)體的混合物。使用高活性異構(gòu)體的農(nóng)藥，可以大大減少釋放到環(huán)境中的農(nóng)藥總量［8］。因此，尋求一種新的、有效的立體選擇性分離方法極具挑戰(zhàn)性，同時，對促進(jìn)評估這些農(nóng)藥對人類、動物和環(huán)境構(gòu)成的風(fēng)險具有重要意義。目前，已有文獻(xiàn)報道高效液相色譜（HPLC）法可用于烯酰嗎啉的立體選擇性分析和測定［12］。但是，該方法分離效果差、保留時間長、靈敏度低，不適合常規(guī)分析。而且，分離過程中使用的大量有毒試劑（如甲醇、乙腈）對環(huán)境有害［14-15］。近年來，超臨界流體色譜法（SFC）作為一種新的分析技術(shù)引起了研究人員的廣泛關(guān)注［16-18］。由于SFC 使用低黏度的CO2作為主要流動相，其流速和分離速度均比HPLC 快。同時，SFC 僅使用少量的有機(jī)溶劑作為流動相的改性劑，有機(jī)溶劑消耗量低于HPLC［19-23］。這些優(yōu)點(diǎn)使得SFC 成為立體異構(gòu)農(nóng)藥分析的首選方法，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥的立體選擇性測定和分離［24-27］。因此，采用超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry，SFC-MS/MS）立體選擇性分離和測定了煙草中烯酰嗎啉的順反異構(gòu)體，旨在為烯酰嗎啉順反異構(gòu)體降解和代謝的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)，并可能為其他農(nóng)藥的立體選擇性分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

10 個烤煙實際樣品全部來自2019 年度國家煙草專賣局農(nóng)殘普查分析樣品。

烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品（＞98.0%，德國Augsburg 公司）；（E）-烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品、（Z）-烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品（＞98.0%，天津阿爾塔科技有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈、乙醇和異丙醇（色譜純，德國Chemicell 公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，上海安普實驗科技股份有限公司）；超純水（自制，電阻率≥18.2 MΩ·cm）；高純氬、高純氮（＞99.99%，鄭州源正特種氣體有限公司）。

ACQUITY 超高效合相色譜儀、ACQUITY TQD 四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧電離源）、Acquity UPC2 Trefoil CEL2 柱和Acquity UPC2 Trefoil AMY1 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（美國Waters 公司）；Chiralcel IG-3 柱和Chiralcel OD-3柱（100 mm×3.0 mm，3.0 μm）（日本Daicel 公司）；分樣篩（孔徑2 mm×直徑10 cm，廣東開平萊雪倫模具有限公司）；5810-R 高速離心機(jī)（美國Eppendorf 公司）；VX200 渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；AEl63 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；0.22 μm 有機(jī)相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

所有樣品在40 ℃烘箱中烘烤24 h 后研磨，并使用孔徑為2 mm 的分樣篩過濾，過濾后的粉末樣品貯存于棕色玻璃瓶中，于4 ℃下保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

稱取10 mg 烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得到一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/mL）。移取100 μL 一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到二級標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10.0 μg/mL）。移取適量的二級標(biāo)準(zhǔn)儲備液并使用乙腈稀釋，制備烯酰嗎啉濃度為1 000、500、200、100、50 和20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液（其中各異構(gòu)體濃度為500、250、100、50、25 和10 ng/mL）。

取6 個1.5 mL 色譜瓶，分別加入200 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液和800 μL 乙腈，得到各異構(gòu)體濃度分別為100、50、20、10、5 和2 ng/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

另取6 個1.5 mL 色譜瓶，加入200 μL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液、600 μL 的乙腈和200 μL 的空白煙草提取物，得到各異構(gòu)體濃度為100、50、20、10、5 和2 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有溶液在-18 ℃保存。

1.2.3 加標(biāo)樣品的制備

空白樣品在回收率實驗中用作空白對照基質(zhì)，并用于制備基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，應(yīng)確保不含烯酰嗎啉。使用前，將空白煙草樣品研磨均勻，并過孔徑2 mm 分樣篩，在室溫下自然風(fēng)干。通過添加相應(yīng)體積的二級標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加標(biāo)樣品。然后在樣品中加入10 mL 甲醇，并機(jī)械振蕩10 min，以使目標(biāo)物均勻分布在樣品中。將樣品放置于通風(fēng)櫥中過夜，使溶劑在室溫下蒸發(fā)。

1.2.4 樣品分析

參考文獻(xiàn)［28］的方法對煙草樣品進(jìn)行QuEChERS 處理：稱取2 g 煙草粉末樣品于50 mL具塞離心管中，加入超純水和乙腈，渦旋振蕩3 min；然后再加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，繼續(xù)渦旋振蕩3 min，靜置；移取1 mL 上清液，加入1.5 mL 離心管中，再加入無水硫酸鎂及PSA，渦旋振蕩、離心；上清液經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾后，取200 μL 濾液，用800 μL 乙腈稀釋，進(jìn)行SFC-MS/MS 檢測。分析條件：

色譜柱：Chiralcel OD-3 柱（100 mm×3 mm，3.0 μm）；動態(tài)背壓：13.79 MPa；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動相：A 相為CO2，B 相為甲醇；洗脫條件：等度洗脫，V流動相A∶V流動相B=98 ∶2；流動相流速：2.0 mL/min；補(bǔ)償溶劑：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的甲醇溶液，流速0.2 mL/min；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：2.8 kV；錐空氣流量：60 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定量分析離子對（m/z）：388.1＞165.1（碰撞電壓30 V，錐孔電壓41 V）；定性分析離子對（m/z）：388.1＞300.9（碰撞電壓20 V，錐孔電壓41 V）；質(zhì)譜掃描方式：正離子掃描。依據(jù)每個色譜峰掃描15～20 個數(shù)據(jù)點(diǎn)且自動調(diào)整停留時間。利用Mass Lynx 4.1 軟件采集所有數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 立體選擇性分離條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

考察了4 種不同的手性色譜柱（Acquity UPC2 Trefoil CEL2，Acquity UPC2 Trefoil AMY1，Chiralpak IG-3 和Chiralcel OD-3）對烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的分離能力，結(jié)果見圖2。在4 種色譜柱中，Acquity UPC2 Trefoil AMY1 和Chiralpak IG-3柱不能分離順反異構(gòu)體。Acquity UPC2 Trefoil CEL2 和Chiralcel OD-3 柱均可實現(xiàn)順反異構(gòu)體的基線分離，但是Acquity UPC2 Trefoil CEL2 柱分離得到的色譜峰峰形不光滑且峰太寬（圖2）。因此，在后續(xù)實驗中選擇Chiralcel OD-3 柱分離烯酰嗎啉順反異構(gòu)體。

圖2 利用4 種不同色譜柱分離烯酰嗎啉異構(gòu)體的SFC-MS/MS 色譜圖Fig.2 Typical SFC-MS/MS chromatograms of dimethomorph isomers separated on four columns

2.1.2 改性劑的影響

極性的有機(jī)改性劑對異構(gòu)體立體選擇性分離的洗脫時間、分離度和洗脫順序均有重要影響［29-30］。為了在Chiralcel OD-3 柱上實現(xiàn)順反異構(gòu)體的良好分離，考察了3 種不同有機(jī)改性劑（甲醇、乙醇和異丙醇）對順反異構(gòu)體分離的影響。結(jié)果（圖3）表明，甲醇可以使兩種異構(gòu)體基線完全分離且色譜峰形良好（圖3a）。相反，當(dāng)使用乙醇時，烯酰嗎啉兩個異構(gòu)體的峰形較差。使用異丙醇作為改性劑時，烯酰嗎啉順反異構(gòu)體不能分開。因此，選擇甲醇作為流動相改性劑。

圖3 改性劑對烯酰嗎啉異構(gòu)體分離的影響Fig.3 Effects of modifiers on separation of dimethomorph isomers

2.1.3 柱溫的影響

柱溫一直是影響超臨界流體色譜立體選擇性分離的重要因素之一。超臨界二氧化碳的密度和黏度隨柱溫升高而降低，導(dǎo)致流動相的洗脫能力下降，保留時間增加［31］?？疾炝酥鶞貜?5 ℃逐步升高到50 ℃（步長為5 ℃）時，烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的分離情況。結(jié)果如圖4 所示，保留時間隨溫度升高而增加。溫度對烯酰嗎啉順反異構(gòu)體分離度的影響較小，但是當(dāng)溫度從35 ℃升至40 ℃時，MS 響應(yīng)信號明顯降低?？紤]到保留時間和MS 響應(yīng)信號，選擇35 ℃為最佳分離溫度。

圖4 柱溫對烯酰嗎啉異構(gòu)體分離效果的影響Fig.4 Effects of column temperature on separation of dimethomorph isomers

2.1.4 動態(tài)背壓的影響

隨動態(tài)背壓升高，超臨界CO2流體密度增加，其對分析物的溶解和洗脫能力也隨之增強(qiáng)，因此目標(biāo)物的保留時間減?。?2］?？疾炝藙討B(tài)背壓從11.03 MPa 逐步增加至15.17 MPa（步長為1.38 MPa）時，烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的分離情況。結(jié)果（圖5）表明，動態(tài)背壓的變化對順反異構(gòu)體的分離度沒有影響；但是，動態(tài)背壓從11.03 MPa 增加到13.79 MPa，會導(dǎo)致MS 響應(yīng)信號顯著增加。因此，選擇動態(tài)背壓13.79 MPa 作為推薦值。

圖5 動態(tài)背壓對烯酰嗎啉順反異構(gòu)體分離情況的影響Fig.5 Effects of ABPR（auto back pressure regulator）on separation of dimethomorph isomers

2.1.5 烯酰嗎啉異構(gòu)體的洗脫順序

在上述最優(yōu)化的實驗條件下，分別將（E）-和（Z）-烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液注入SFC-MS/MS 系統(tǒng)中，（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉在Chiralcel OD-3 柱上的洗脫順序依次為（E）-烯酰嗎啉（3.68 min）、（Z）-烯酰嗎啉（4.15 min）。在最優(yōu)條件下，煙草實際加標(biāo)樣品的選擇離子色譜圖如圖6所示。

圖6 加標(biāo)樣品的典型SFC-MS/MS 色譜圖Fig.6 Typical SFC-MS/MS chromatogram of the spiked tobacco sample

2.2 方法驗證

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是由共洗脫的基質(zhì)組分產(chǎn)生的，這些組分會影響目標(biāo)分析物的電離，在某些情況下會導(dǎo)致目標(biāo)分析物離子抑制或離子增強(qiáng)［33］。通過溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行比較研究基質(zhì)效應(yīng)。如表1 所示，（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉的基質(zhì)效應(yīng)分別為-59.8%和-69.3%，表明其信號被強(qiáng)烈抑制。因此，使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量以獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

2.2.2 線性方程、檢出限和定量限

通過分析溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（2～100 ng/mL）考察方法的線性。通過繪制順反異構(gòu)體峰面積與濃度的關(guān)系圖生成校準(zhǔn)曲線。通過使用低濃度的加標(biāo)樣品確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），分別以信噪 比（S/N）為3 和10時的濃度定義為LOD 和LOQ。如表1所示，各異構(gòu)體線性關(guān)系良好（R2≥0.994 3），（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉的LOD和LOQ 均較低，可以滿足定量分析的需要。

表1 烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的線性方程、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Tab.1 Regression equation，matrix effect，LODs，and LOQs for the isomers of dimethomorph

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

回收率實驗用于評估該方法的準(zhǔn)確性和精密度。制備3 個不同濃度（分別為0.02、0.2 和2.0 mg/kg）的加標(biāo)樣品，依據(jù)上述步驟提取和凈化，每個濃度樣品平行測定5 次，連續(xù)測定3 d。使用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評估該方法的精密度。如表2 所示，在所有加標(biāo)水平下均獲得滿意的平均回收率（87.3%～102.3%）。方法的日內(nèi)精密度（n=5）和日間精密度（n=15）分別為2.7%～4.9%和3.3%～5.9%。

表2 方法的準(zhǔn)確度和精密度Tab.2 Accuracies and precisions of the proposed method

2.3 方法的應(yīng)用

采用本方法測定了10 個來自不同產(chǎn)區(qū)的煙草樣品，結(jié)果顯示：僅在1 個樣品中檢出（E）-和（Z）-烯酰嗎啉，二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.18 和1.22 mg/kg。該結(jié)果也表明，烯酰嗎啉在煙草上施用時是以異構(gòu)體混合物的形式存在的。

3 結(jié)論

①建立了超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分離和測定煙草中烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的方法，該方法主要以CO2為流動相，在5 min 內(nèi)即可實現(xiàn)烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的基線分離。②在最優(yōu)化的分離條件下，烯酰嗎啉順反異構(gòu)體的回收率在87.3%～102.3%之間，日內(nèi)精密度為2.7%～4.9%，日間精密度為3.3%～5.9%。③該方法具有綠色、快速、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于分離和測定煙草實際樣品中的烯酰嗎啉異構(gòu)體。