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    柑桔葉斑駁病毒江西分離物全基因組序列測定與分析

    2021-06-23 11:01:34鐘家美黃愛軍
    中國南方果樹 2021年3期
    關鍵詞:核苷酸柑桔獼猴桃

    丁 敏,王 瑩,鐘家美,黃愛軍

    (贛南師范大學生命科學學院/國家臍橙工程技術研究中心,江西贛州,341000)

    柑桔葉斑駁病毒(Citrusleafblotchvirus, CLBV)屬于乙型線形病毒科柑桔病毒屬,是一種正義單鏈RNA病毒,在多數(shù)柑桔品種上不引起明顯癥狀[1],但可引起德威特桔橙(Dweet tangor,Citrusreticulate×C.sinensis)斑駁花葉癥狀和在香櫞(‘Etrog’ citron,C.medica)上引起莖陷點癥狀[2-3],還可能與以枳橙或枳柚做砧木時的砧穗不親和癥狀有關[4]。目前CLBV已在美國、西班牙、澳大利亞等多個國家報道,寄主范圍包括柑桔、甜櫻桃、獼猴桃和牡丹[5-7]。我國于2017年首次在檸檬上檢測出該病毒[8]。CLBV在自然條件下通過病穗嫁接和帶毒工具農(nóng)事操作進行傳播,同時有證據(jù)顯示,CLBV具有一定的種傳概率[9-10]。雖然目前未見CLBV在柑桔產(chǎn)業(yè)上引起顯著危害的報道,但是不能排除該病毒對特定柑桔品種或者與其他病毒有協(xié)同作用產(chǎn)生嚴重危害。

    目前報道的所有CLBV基因組結構均相同,基因組5’和3’端各有一段非編碼區(qū)(untranslated regions, UTRs),5’端有甲基化帽子結構,3’端有ploy A尾巴;其余包含有3個開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1編碼一個227 kDa的多聚蛋白,這個多聚蛋白經(jīng)酶切割后,得到不同功能的蛋白,包括甲基轉(zhuǎn)移酶、AlkB蛋白、木瓜蛋白酶樣蛋白酶、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶。ORF2編碼約40 kDa的細胞間運動蛋白。ORF3編碼約41 kDa的外殼蛋白[11-13]。Li等[14]測定分析了中國4個不同省份柑桔樣品上的CLBV全長序列,核酸序列一致度在98.9%~99.8%間,表現(xiàn)出較小變異程度;而項周等[15]對來自湖北和四川的14個CLBV的CP基因分析結果顯示,CP基因核苷酸和氨基酸序列差異分別可達18%和12%,表現(xiàn)出較大的變異程度。目前,尚未有江西CLBV全長序列的報道。本研究擬通過對CLBV全基因序列測定,對其序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關系等進行分析。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料感染CLBV的紐荷爾臍橙(C.sinensisOsbeck)樣品于2017年采集于江西省萬安縣窯頭鎮(zhèn)通津村柑桔園,樣品葉片上并未表現(xiàn)出斑駁黃化癥狀。采集感病植株的枝條進行嫁接,保存于國家臍橙技術研究中心溫網(wǎng)室,并采集葉片低溫保濕帶回實驗室進行RNA抽提。抽提RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要試劑植物總RNA提取試劑RNAiso Plus,PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒,SMARTer 5'/3' kit、PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒為寶生物工程公司產(chǎn)品。pEASY-Blunt Zero Cloning Kit,Trans1 -T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞為北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品。所有操作均參照試劑盒說明書進行。所得植物總RNA采用Nanodrop 2000(Thermo Scientific,美國)檢測其濃度和純度。CLBV基因組5’和3’端RACE擴增引物,根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的基因組序列的保守區(qū)設計特異性引物,所有引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。所用引物的相關信息見表1。

    表1 柑桔葉斑駁病毒全基因組擴增引物相關信息

    1.3 試驗方法CLBV基因組全長擴增、克隆及測序:采用RNAiso試劑從采集的感病葉片樣品中提取總RNA,具體步驟參照說明書。以總RNA為模板,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。反應體系(20 μL):隨機引物(Random 6 mers)1.0 μL,10 m mol/L的dNTP溶液1.0 μL,RNase Free 單蒸水6.0 μL,RNA模板2.0 μL,以上反應液置于PCR儀上65 ℃解鏈5 min,然后取出立即置于冰上冷卻約2 min,再依次加入5× PrimeScript Buffer 4.0 μL,RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL,PrimeScript RTase(200 U/μL)1.0 μL,RNase Free 單蒸水4.5 μL,30 ℃反應10 min,42 ℃反應50 min,95 ℃反應5 min酶失活后,冰上冷卻。 PCR擴增反應體系(25 μL):5× PrimeSTAR GXL Buffer 5.0 μL,2.5 m mol/L的dNTP溶液2.0 μL,10 μ mol/L正向引物/反向引物0.5 μL,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板1.0 μL,滅菌水15.5 μL。擴增反應步聚為:98 ℃變性10 s,60 ℃退火15 s,68 ℃延伸時間視片段長度而定(按1 min / kb計算)。PCR反應結束后,取5 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行條帶檢測。目的條帶的膠回收純化參照試劑盒說明進行。經(jīng)純化產(chǎn)物與全式金pEASY-Blunt Zero載體連接后,轉(zhuǎn)化Trans1 -T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞。每個條帶至少挑選3個以上陽性克隆進行測序。病毒5’/3’端擴增采用SMARTer 5’/3’試劑盒,步驟按照說明書進行。擴增所得目的條帶克隆、測序步驟同上。

    序列分析:測序所得結果應用Megalign軟件(DNASTAR)進行序列拼接,得到病毒序列全長。分析所用CLBV分離物序列均下載自GenBank,利用在線軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行序列一致性分析。序列比對及進化樹構建采用MEGA 6.06軟件,以鄰接法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap值設置為1 000次。

    2 結果與分析

    2.1 CLBV江西分離物的全基因組序列特征利用3對CLBV特異性引物通過RT-PCR擴增得到3條片段大小為3 224、3 219和2 490 bp的目的條帶;利用RACE技術和巢式PCR擴增獲得5’端和3’端序列,片段大小分別為471和557 bp。分離物全基因組分段擴增結果如圖1所示,各片段結果均符合預期擴增片段大小。

    通過測序、拼接獲得了CLBV分離物基因組全長為8 747 nt,將其命名為CLBV-JX,提交GenBank后序列號為MT863785。該分離物全長序列包含3個ORF,ORF1(74-5 962)編碼多聚蛋白,ORF2(5 962-7 050)編碼移動蛋白,ORF3(7 115-8 206)編碼外殼蛋白,5’端和3’端非翻譯區(qū)分別為73和541 nt,ORF2 和ORF3之間有一段64 bp的間隔區(qū)(見圖1)。

    注:在電泳圖中,1為5’端RACE,2為KU52/KU58,3為KU59/KU60,4為KU61/KU62,5為3’端RACE擴增產(chǎn)物。

    2.2 CLBV江西分離物與其他來源分離物的序列一致性序列一致性分析顯示,在全基因組水平上,CLBV-JX與其他6個CLBV分離物的一致度為74.3%~97.2%,與柑桔來源的分離物一致度高(96.8%~97.2%),與獼猴桃來源的分離物一致度最低,僅為74.3%。在5’和3’端非編碼區(qū)上,核苷酸一致度分別為77.9%~98.6%和62.7%~98.9%。在3’端非編碼區(qū)表現(xiàn)出更大的變異性,CLBV-JX與來源于甜櫻桃的分離物(KR023647)一致度僅為62.7%。3個編碼框區(qū)域,核苷酸一致度分別為72.7%~97.1%、78.2%~96.4%和79.0%~98.8%,氨基酸一致度分別為79.4%~98.5%、96.1%~100%和88.0%~98.8%。當CLBV分離物來源寄主是柑桔時,核苷酸和氨基酸水平變異小,當寄主是甜櫻桃和獼猴桃時,核苷酸和氨基酸水平變異大(見表2)。這可能與病毒適應不同寄主有關。

    表2 CLBV-JX9分離物(MT863785)與其他來源CLBV分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性 %

    2.3 CLBV江西分離物基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育以不同來源CLBV分離物的核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析的結果表明,所有來源于柑桔的CLBV分離物緊密聚為一支,表現(xiàn)出較近的遺傳發(fā)育關系。來源于甜櫻桃的CLBV分離物與來源柑桔的CLBV分離物聚為一個大支,遺傳發(fā)育關系變遠。來源于獼猴桃的3個CLBV分離物形成了兩個單獨分支,與以上分離物表現(xiàn)出較遠的遺傳距離(見圖2)。以上結果說明,CLBV在進化上可能與對寄主的適應性存在一定相關性,在柑桔上目前遺傳變異還較小,而在獼猴桃上變異較大。

    圖2 不同來源CLBV分離物基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 小結與討論

    本研究利用克隆、測序等技術獲得了CLBV-JX分離物的全基因組序列,并對CLBV-JX與其他寄主來源CLBV分離物的序列進行了一致性和系統(tǒng)發(fā)育分析。CLBV-JX全長8 747 nt,編碼3個ORF。序列一致度比較結果顯示,CLBV-JX與來源于柑桔的分離物序列一致度高,核苷酸和氨基酸序列一致度均高于95.9%,這與Vives等[16]所得結果相同。CLBV-JX與來源于甜櫻桃和獼猴桃的分離物的一致性低,ORF1和ORF3編碼的氨基酸序列一致度最低,分別為79.4%和88.0%,特別是在3’端非編碼區(qū),核酸一致度僅為62.7%,顯示出該病毒在不同寄主上的高度變異特性。項周等[15]和朱晨熹等[17]針對中國不同CLBV分離物的CP序列分析,發(fā)現(xiàn)其在不同寄主間也表現(xiàn)出較大的分子變異。本試驗構建的CLBV不同分離物全基因組的核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹顯示,所有柑桔來源CLBV分離物緊密聚為一支,并沒有明顯的地理差異,但與其他寄主來源分離物表現(xiàn)出較遠的系統(tǒng)發(fā)育距離。目前,對不同地區(qū)其他寄主來源的CLBV分離物報道不多。例如:獼猴桃在我國南方地區(qū)也有一定種植面積,但對寄主為南方獼猴桃的CLBV分離物研究相對較少;另外以芍藥為寄主的CLBV全基因序列還未有報道。因此,無法確定其他寄主來源CLBV分離物是否存在地理差異。不同寄主間核苷酸序列一致度低在類似病毒的相關研究中也有發(fā)現(xiàn)。如:趙磊[18]對已報道的所有蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)的CP基因進行系統(tǒng)進化分析,發(fā)現(xiàn)其在以蘋果、梨樹和柑桔為寄主的分離物間的核苷酸序列存在較大差異,但不同地域間的序列一致度沒有明顯差異;王利平等[19]發(fā)現(xiàn),蘋果褪綠斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)群體具有遺傳多樣性,且不同分離物間親緣關系呈現(xiàn)一定的地域相關性。本研究表明,不同寄主來源CLBV分離物間的核苷酸和氨基酸序列差異較大,可能是因為CLBV需要適應不同寄主環(huán)境而發(fā)生了變異,此推測有待進一步驗證。同時,對于CLBV全基因序列的地理差異,還需通過對其他寄主來源進行深入研究。

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