香蕉枯萎病拮抗放線菌的分離鑒定及抑菌機(jī)理分析

張惠茜，王 尉，周登博，云天艷，陳宇豐，謝江輝

(1 海南大學(xué)園藝學(xué)院，?？?，570228；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?，571101)

香蕉(Musaspp.)屬于芭蕉科(Musaceae)、芭蕉屬(Musa)單子葉植物，是重要的果糧兼用作物。我國是世界香蕉第一大消費國和第二大生產(chǎn)國，主要栽培香蕉品系為“香芽蕉”(Cavendish，AAA)[1]。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf. sp.cubense(簡稱Foc)，引起的維管束病害，為害我國香蕉種植區(qū)的主要為4號生理小種(Foc 4)，該小種侵染幾乎所有香蕉品種[2]。目前，尚未培育出農(nóng)藝性狀較好的抗病品種，對于香蕉枯萎病的控制仍以傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥為主，而此方法不僅污染環(huán)境，還會誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性[3]。利用生防菌進(jìn)行微生物防治，不僅能克服化學(xué)防治帶來的副作用，還能維持土壤菌群平衡。

當(dāng)前，用于防治香蕉枯萎病的生防菌有芽孢桿菌、木霉和放線菌三大類。楊迪等從廣西蕉園土壤中分離出1株貝萊斯芽孢桿菌Blz02，對香蕉枯萎病的盆栽防效達(dá)到63.33%[4]。郭立佳等從香蕉根系土壤中分離出1株芽孢桿菌JK05，對香蕉枯萎病的盆栽防效達(dá)到了70.5%[5]。覃柳燕等從香蕉根系土壤中分離得到1株棘孢木霉PZ6，對香蕉枯萎病的盆栽防效為48.28%[6-7]。Jing等從健康的香蕉園中分離出1株放線菌JBS5-6，對香蕉枯萎病的防效達(dá)到64.94%[8]。盡管發(fā)現(xiàn)了一些具有作用的拮抗菌，但是不同生防菌的生長狀態(tài)及大田應(yīng)用效果仍有待評價，因此，分離和鑒定高效拮抗菌仍是未來生防的重要課題。

本研究以Foc 4為靶標(biāo)菌，從尖峰嶺國家森林公園潤楠根系土壤中分離得到1株具有良好拮抗作用的鏈霉菌JRGG-11；通過表型分析和16S rRNA聚類分析對JRGG-11的種屬進(jìn)行鑒定；盆栽試驗進(jìn)一步明確該菌防效，并對其抑菌機(jī)理進(jìn)行了分析，研究結(jié)果有利于豐富香蕉枯萎病菌拮抗微生物資源庫，開發(fā)生物菌肥。

1 材料與方法

1.1 材料

拮抗菌株分離材料：海南省尖峰嶺國家森林公園1株潤楠Machiluspingii的根際土壤。

供試培養(yǎng)基：腐殖酸—維生素瓊脂培養(yǎng)基(HV)、葡萄糖—天冬氨酸培養(yǎng)基(GA)、淀粉—酪蛋白培養(yǎng)基(SIM)、淀粉酪素瓊脂培養(yǎng)基(SCA)、酵母膏麥芽膏培養(yǎng)基(YE/ISP2)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)、黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基(SLM)。

供試病原菌：香蕉枯萎病菌4號生理小種(Foc 4)保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/海南省熱帶微生物資源重點實驗室。

植物材料：6～7葉巴西蕉(Musaspp.，AAA)杯苗，種植用土取自海南省儋州市健康香蕉園。

1.2 拮抗放線菌的分離篩選

土樣自然風(fēng)干，充分研磨后過60目篩，稱取樣品5 g，溶于45 mL無菌水，55 ℃加熱20 min，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)1 h。用無菌水稀釋為終濃度10-1、10-2、10-3的土壤懸浮液，分別吸取稀釋液0.15 mL涂布于分離培養(yǎng)基(HV、GA、SIM、SCA)上，28 ℃培養(yǎng)7 d，取不同單菌落于YE培養(yǎng)基上純化[9]。

拮抗菌株初篩：采用平板對峙培養(yǎng)法[10]篩選Foc 4拮抗放線菌，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5) ×100，菌落直徑單位為mm。

拮抗菌株復(fù)篩：將純化后的放線菌接種到SLM中，28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)7 d，得到發(fā)酵液，加入與發(fā)酵液等量的95%乙醇萃取2 d，過濾菌體，得到發(fā)酵液萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，無菌水稀釋至終濃度20 mg/mL。用瓊脂孔洞擴(kuò)散法[11]測定放線菌發(fā)酵液對Foc 4抑菌活性，十字交叉法測定抑菌率。

1.3 拮抗放線菌的分類鑒定

參考徐麗華等方法進(jìn)行生理生化鑒定[12]。取YE培養(yǎng)基上生長良好的菌落，參照張文娟[13]的方法進(jìn)行掃描電鏡樣品處理，通過掃描電鏡觀察放線菌菌絲和孢子的形態(tài)。采用北京BioTeke生物技術(shù)有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒分離總DNA。細(xì)菌鑒定通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司測序。GenBank和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫用于同源性比對，使用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 盆栽試驗

將帶有GFP熒光的Foc 4孢子液接種至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖菌3 d，用4層紗布過濾得到孢子懸浮液，于10 000 r/min室溫離心，無菌水洗去培養(yǎng)基，制備成106CFU/mL病原菌孢子懸浮液。設(shè)置3個處理：即Foc 4處理，F(xiàn)oc 4孢子懸浮液浸泡香蕉苗30 min后定植于盆內(nèi)，每7 d澆Foc 4孢子液100 mL和SLM培養(yǎng)基100 mL，連澆3周。Foc 4+JRGG-11處理，F(xiàn)oc 4孢子懸浮液浸泡香蕉苗30 min后定植于盆內(nèi)，每7 d澆Foc 4孢子液100 mL和濃度為108CFU/mL的JRGG-11發(fā)酵液(由SLM培養(yǎng)基發(fā)酵)100 mL，連澆3周。對照，每7 d給香蕉苗澆SLM培養(yǎng)液100 mL。每處理香蕉苗30株，于28 ℃、70%相對濕度和12 h光照+12 h黑暗下培養(yǎng)。接種7 d和14 d后分別選取3個處理香蕉苗根系，用激光共聚焦顯微鏡觀察Foc 4孢子侵染情況。發(fā)病率和病情指數(shù)參照周登博等[14]方法計算。

1.5 抑菌機(jī)理

依據(jù)1.2的方法獲取的拮抗放線菌發(fā)酵液萃取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至200 mL，利用色譜柱層析法將濃縮后的萃取液用50%、60%、70%、100%甲醇進(jìn)行洗脫并蒸干，獲得活性物質(zhì)提取物。用50%甲醇溶解提取物至20 mg/mL作為母液，保存于4 ℃冰箱。配制成含藥平板測定不同濃度甲醇洗脫的提取物活性。利用最小二乘法建立線性回歸[15]，根據(jù)毒力回歸方程計算EC50和EC95值。孢子萌發(fā)測定依據(jù)Wei等[16]的方法進(jìn)行。

通過掃描電子顯微鏡(model S-4800，Hitachi Limited，Japan)觀察4×EC50處理下Foc 4菌絲形態(tài)，通過透射電子顯微鏡(JEM-1400 Flash，Hitachi Limited，Japan)觀察4×EC50處理下Foc 4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Foc 4拮抗放線菌的分離篩選

將根際土壤在4種分離培養(yǎng)基上稀釋涂布，共分離得到放線菌61株，以Foc 4靶標(biāo)進(jìn)行初篩，得到對Foc 4菌絲生長具有抑菌作用的放線菌17株，其中編號為JRGG-11的放線菌抑菌效果最好，初篩對Foc 4的抑菌率為(80.48±1.49)%，發(fā)酵液復(fù)篩對Foc 4抑菌率為(58.77±1.31)%(見圖1)。

圖1 放線菌JRGG-11對香蕉枯萎病菌的抑菌活性

2.2 放線菌JRGG-11的分類鑒定

2.2.1 放線菌JRGG-11生理生化鑒定 通過碳、氮源測試發(fā)現(xiàn)，菌株JRGG-11對鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、D-纖維二糖、D-木糖、木聚糖、海藻糖、松三糖等8種碳源有偏好性，能夠較好地利用組氨酸、天門冬酰胺、L-羥基脯氨酸、硝酸鉀、蛋白胨、朊蛋白胨、酵母膏、酪蛋白等8種氮源。酶學(xué)測試發(fā)現(xiàn)菌株JRGG-11過氧化氫酶、硝酸還原、明膠液化、淀粉水解、纖維素水解、色氨酸、脲酶、脂酶等測試均為陽性，最適pH值7，對NaCl的耐受性小于7%(見表1)。

表1 放線菌JRGG-11的生理生化特性

2.2.2 放線菌JRGG-11分子生物學(xué)鑒定和掃描電鏡 菌株JRGG-11在掃描電鏡下的形態(tài)見圖2，可以看出孢子呈球形，表面有類似毛發(fā)的刺狀凸起。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株JRGG-11與菌株StreptomycesalbospinusNBRC 13846聚為一支，但置信度較低，無法確定具體種，結(jié)合生理生化特性，將菌株JRGG-11歸為鏈霉菌屬，在NCBI上登錄號為MW110901(見圖2)。

圖2 放線菌JRGG-11的鑒定

2.3 菌株JRGG-11發(fā)酵液的盆栽防效

從圖3香蕉根系切片可以看出，在病原菌處理7 d后，F(xiàn)oc 4處理的香蕉苗根表皮細(xì)胞富集了大量Foc 4孢子，14 d時中部導(dǎo)管有大量孢子附著。Foc 4和JRGG-11發(fā)酵液處理的香蕉苗根表皮只有少量Foc 4孢子分布。當(dāng)Foc 4處理出現(xiàn)明顯的枯萎病癥狀時，其香蕉苗葉片大量枯黃，病情指數(shù)達(dá)到67.62；Foc 4+JRGG-11處理香蕉苗僅有少量枯黃葉片，病情指數(shù)為11.43。菌株JRGG-11對Foc 4防控效果達(dá)到83.10%。

注：左圖為不同處理香蕉幼苗根系中GFP-Foc 4定殖情況，右圖為不同處理香蕉幼苗病變癥狀。

2.4 菌株JRGG-11提取物的抑菌機(jī)理

2.4.1 JRGG-11提取物的活性測定 從圖4可以看出，用不同濃度的甲醇對菌株JRGG-11發(fā)酵液的活性成分進(jìn)行提取，對比提取物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)100%甲醇洗脫得到的提取物活性最好，對Foc 4的抑制率達(dá)到(99.25±0.19)%。對100%甲醇洗脫的提取物進(jìn)行毒力回歸方程測定，得到回歸方程為Y=3.206 6+1.410 1X(R=0.99)，EC50為18.70 μg/mL，EC95為274.43 μg/mL。

注：a.不同濃度甲醇洗脫得到的JRGG-11提取物的抑菌活性，b.不同濃度JRGG-11提取物對Foc 4菌絲生長的影響。不同小寫字母表示在p<0.05水平上的差異顯著性。

2.4.2 JRGG-11提取物處理對Foc 4孢子萌發(fā)的影響 從圖5和表2 Foc 4孢子萌發(fā)情況可以看出，在JRGG-11提取物處理下，F(xiàn)oc 4孢子萌發(fā)受到抑制。2×EC50時，僅有少量孢子萌發(fā)，在4×EC50時，F(xiàn)oc 4孢子萌發(fā)完全被抑制。CK和1×EC50、2×EC50處理下，孢子萌發(fā)率之間存在顯著性差異，2×EC50處理的Foc 4孢子萌發(fā)率僅為CK的1/3。相比CK，1×EC50和2×EC50處理下的Foc 4孢子芽管長度分別縮短了40.18%和63.61%。

注：a—e分別為提取物0(無菌水，CK)、1×EC50、2×EC50、4×EC50、8×EC50 mg/L處理。

表2 放線菌JRGG-11不同濃度提取物對Foc 4孢子的影響

2.4.3 JRGG-11提取物對Foc 4菌絲形態(tài)特征的影響 從圖6a和圖6b可以看出，正常的Foc 4菌絲表面光滑，粗細(xì)均一，菌絲分布較為整齊。而從圖6c至圖6g可以看出，4×EC50濃度JRGG-11提取物處理后，F(xiàn)oc 4菌絲出現(xiàn)大面積膨大、破裂和皺縮現(xiàn)象，菌絲分布雜亂，頂端明顯的膨大、斷裂和皺縮。

2.4.4 JRGG-11提取物處理對Foc 4菌絲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 從圖7可以看出，透射電鏡檢測Foc 4菌絲超微結(jié)構(gòu)，未經(jīng)JRGG-11提取物處理的Foc 4病原菌細(xì)胞，其細(xì)胞壁光滑完整，厚薄均一，細(xì)胞器清晰可見。經(jīng)過4×EC50濃度JRGG-11提取物處理后，病原菌的細(xì)胞壁明顯增厚，細(xì)胞器模糊，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大囊泡；細(xì)胞質(zhì)和囊泡內(nèi)基質(zhì)明顯流失和濃縮，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象；之后細(xì)胞壁開始溶解，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器溶解；細(xì)胞空腔化現(xiàn)象明顯，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁分離。

3 結(jié)論與討論

尖峰嶺是位于海南的熱帶原始森林，獨特的氣候孕育了豐富的微生物資源，筆者從尖峰嶺潤楠根際土壤分離出的Foc 4拮抗放線菌JRGG-11歸為鏈霉菌屬，該屬是主要的抗生素生產(chǎn)菌，也是在農(nóng)業(yè)上運用較多的一類生防菌。其抑菌作用機(jī)制主要有4種：生態(tài)位競爭、抗生作用、重寄生作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。抗生作用為最直接的抑菌方式，主要通過產(chǎn)生多肽類、聚酮類、核苷類或者水解酶等次級代謝物來抑制甚至殺死病原菌。

注：a和b為對照，c為4×EC50濃度JRGG-11提取物處理3 d的Foc 4菌絲形態(tài)；f和g分別為放大的d和e。a、c放大500×；b、f、g放大3 000×。

注：a為無菌水處理，b—f為4× EC50濃度JRGG-11提取物處理。

Jeong等從鏈霉菌CA5中提取出1種多烯大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)CA5A，對葡萄灰霉病菌有良好的抑制作用[17]；覃可等發(fā)現(xiàn)鏈霉菌FT05W中含有幾丁質(zhì)酶，抑制煙草黑脛病菌生長[18]。劉亞南等發(fā)現(xiàn)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產(chǎn)物roflamycoin能夠顯著抑制4種病原菌生長[19]。本研究中，鏈霉菌JRGG-11提取物處理后的Foc 4菌絲發(fā)生斷裂、膨脹，可以看出其活性物質(zhì)直接作用于菌體，通過抗生作用殺死菌絲。Feng等報道的CPT-11對杧果炭疽病的作用[20]以及王志芳等報道的Streptomycesalboflavus對串珠鐮刀菌的作用[21]也有類似結(jié)果出現(xiàn)。

盆栽試驗顯示，菌株JRGG-11的發(fā)酵液對Foc 4的防控效果達(dá)到了83.10%，優(yōu)于賴寶春等[22]從辣椒根系土壤中分離出的Foc 4拮抗菌灰銹赤鏈霉菌FX81(對香蕉枯萎病盆栽防效81.05%)，及周維等[23]從健康的香蕉植株根部分離出的解淀粉枯草芽孢桿菌G9R-3(對Foc 4盆栽防效65.00%)，但和葉乃瑋等用3株木霉制成的復(fù)合菌肥(對Foc 4防效89.73%)[24]相比效果稍差。大田不同于盆栽試驗，其生產(chǎn)環(huán)境多變且情況復(fù)雜，用單菌作為生防制劑或者菌肥往往效果欠佳，而通過不同功效的菌株組合制成多功能復(fù)合菌制劑可以達(dá)到更好效果，后續(xù)研究將探索JRGG-11復(fù)合菌制劑的生產(chǎn)。