穿梅三黃散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

陳 巍，張小華，陳 毓，金鴻亮，卓 寒

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

中藥散劑是指一種或數(shù)種中藥材或中藥材提取物經(jīng)粉碎、 混勻制成的粉狀制劑。 散劑始載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》， 在其他古代本草著作中亦有大量記載，是最古老的劑型之一。 散劑歷代應(yīng)用頗多，迄今仍為常用劑型之一［1］。

中獸藥穿梅三黃散由大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅5 味藥材組成，依據(jù)處方的組成，采用主要藥材名稱的縮寫并結(jié)合劑型特點而命名。 該品為灰黃色粉末，氣微香，味微苦，具有清熱解毒功效， 在魚病的防治中主要用于細(xì)菌性敗血癥、腸炎、爛鰓與赤皮?。?］。 為進一步提升藥品質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，該試驗采用顯微鑒別法對制劑中大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅進行顯微特征研究，并采用薄層色譜法（TLC）分別對制劑中大黃和黃柏進行定性控制研究，對制劑的外觀均勻度、水分、裝量差異等進行了測定研究［3-4］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的3 批穿梅三黃散分別來自常州億美達生物科技有限公司， 批號190801； 宜興市蘇亞達生物技術(shù)有限公司， 批號190725；自制樣品，批號190828。

1.1.2 對照品與對照藥材大黃酸對照品， 批號110757—201906；大黃對照藥材，批號190984—201906；黃柏對照藥材，批號131414—201907，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 儀器OLYMPUSCX-31 系統(tǒng)顯微鏡（OLYMPUS）；電子天平（AY120，日本島津公司）；BT-125D 電子分析天平；UV-2250 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；硅膠H 薄層板（青島海洋化工廠分廠，20190506，規(guī)格：100 mm×200 mm；厚度：0.20～0.25 mm，活度：三色分開）；硅膠G 薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司，20181210，規(guī)格：100 mm×200 mm；厚度：0.20～0.25 mm，活度：三色分開）。

1.1.4 試劑石油醚（30～60 ℃）、甲酸乙酯、甲酸均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 外觀均勻度檢查取供試品適量， 置于光滑紙上，平鋪約5 cm2，將表面壓平，在明亮處觀察，應(yīng)色澤均勻，無花紋與色斑。

1.2.2 水分含量測定依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015 年版二部 “水分測定法” 項下第一法（烘干法）進行測定，計算供試品中含水量［2］。

1.2.3 裝量差異檢查按照 《中華人民共和國獸藥典》2015 年版二部附錄 “最低裝量檢查法”檢 查［2］。

1.2.4 顯微鑒別參照《中華人民共和國獸藥典》2015 年版二部，取穿梅三黃散粉末少許置載玻片上，滴加2～3 滴水合氯醛試液，按照熱透化方法進行操作，在酒精燈上方加熱并不斷攪拌藥粉，直至藥粉細(xì)胞完全透化，再滴加適量稀甘油試劑，蓋好蓋玻片，在顯微鏡下觀察特征［2］。

1.2.5 薄層色譜鑒別（TLC）

1.2.5.1 大黃TLC取穿梅三黃散粉末0.3 g，置于錐形瓶，加甲醇20 mL，室溫浸漬1 h，過濾，取5 mL 濾液， 在水浴鍋上蒸干， 殘渣中加入10 mL蒸餾水溶解，再加入1 mL 鹽酸試劑，置水浴鍋加熱回流30 min，立即冷卻至室溫，用乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙醚萃取液，在水浴鍋上蒸干，殘渣加1 mL 三氯甲烷溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g， 按照同法制成對照藥材溶液。 取大黃酸對照品，加甲醇制成每毫升含有1 mg 的溶液，作為對照品溶液。采用薄層色譜法進行鑒定，吸取上述3 種溶液各4 μL，在同一塊羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上點樣，以石油醚（30～60 ℃）∶甲酸乙酯∶甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.5.2 黃柏TLC參照《中華人民共和國獸藥典》2015 年版二部中黃柏藥材及含有黃柏藥材的復(fù)方制劑如意金黃散等的薄層色譜方法［2］。 取穿梅三黃散粉末3 g，置于錐形瓶內(nèi)，加入20 mL 甲醇試劑，超聲處理20 min 后過濾，將濾液在水浴鍋上蒸干，得殘渣，再加入4 mL 甲醇試劑使殘渣溶解，作為供試品溶液。 另取黃柏對照藥材0.1 g，加甲醇試劑20 mL，超聲處理20 min 后過濾，濾液置水浴鍋上蒸干，得殘渣，加入4 mL 甲醇試劑使殘渣溶解，作為對照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加入甲醇試劑制成每毫升含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。采用薄層色譜法進行鑒定，吸取上述4 種溶液各2 μL，在同一硅膠G 薄層板上進行點樣操作， 以苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶異丙醇∶濃氨試液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀均勻度檢查

經(jīng)檢查，3 批樣品的外觀色澤均勻，無花紋和色斑，均勻度符合規(guī)定，具體結(jié)果見表1。

表1 3 批樣品外觀均勻度檢查結(jié)果

2.2 水分含量測定

根據(jù)表2 可知， 測得3 批樣品的水分含量分別為7.0%、6.8%、7.5%，均低于10%，符合規(guī)定。

表2 3 批樣品水分檢查結(jié)果 單位：%

2.3 裝量差異檢查

經(jīng)檢查，3 批樣品裝量不少于標(biāo)準(zhǔn)量的97%，均符合規(guī)定，具體結(jié)果見表3。

表3 3 批樣品裝量差異檢查結(jié)果 單位：g

2.4 顯微鑒別

穿梅三黃散的顯微鑒別結(jié)果見圖1～圖6，顯微鏡放大倍數(shù)為10×40=400 倍。

由圖1 可知， 經(jīng)透化的大黃粉末在鏡下可觀察到草酸鈣簇晶，棱角短鈍，直徑60～140 μm；由圖2 可知， 透化后的黃芩粉末在鏡下可觀察到纖維細(xì)胞，呈淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細(xì)；由圖3 可知， 透化后的黃柏粉末在鏡下可觀察到晶鞘纖維，鮮黃色，含晶細(xì)胞的壁木化增厚；由圖4 可知，透化后的烏梅粉末在鏡下可觀察到果皮表皮細(xì)胞，淡黃棕色，細(xì)胞表面呈多角形，壁稍厚［5］；由圖5 可知， 烏梅粉末中表皮細(xì)胞布有單細(xì)胞非腺毛或毛茸脫落后的痕跡；由圖6 可知，透化后的穿心蓮粉末在鏡下可觀察到葉表皮組織中含鐘乳體晶細(xì)胞。

圖2 梭形纖維（黃芩）

圖3 晶鞘纖維（黃柏）

圖4 果皮細(xì)胞（烏梅）

圖5 果皮細(xì)胞（非腺毛，烏梅）

圖6 鐘乳體（穿心蓮）

2.5 薄層色譜鑒別（TLC）

2.5.1大黃TLC 由圖7～圖9 可知，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的5 個橙黃色斑點；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的橙黃色熒光斑點，氨氣熏蒸后，斑點由橙黃色變?yōu)榧t色。 不同生產(chǎn)單位的3 批樣品的薄層圖譜均能顯示樣品中大黃的特征。

圖7 190828 樣品穿梅三黃散大黃薄層圖

2.5.2黃柏TLC 由圖10 可知，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上， 顯示相同顏色的熒光斑點；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的一個黃色熒光斑點。 但從圖中2 次平行試驗結(jié)果可以看出， 對照品和樣品的主斑點不在同一位置，薄層色譜條件有待摸索，故建議該鑒別不列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。

圖1 草酸鈣簇晶（大黃）

3 討論

中獸藥或者獸醫(yī)中藥是指用于預(yù)防或治療動物疾病、促進動物生長的中藥。我國是世界上唯一完整保留獨特傳統(tǒng)醫(yī)藥理論體系的國家。 中獸藥為我國傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)的重要組成部分， 已有兩千多年的歷史。中獸藥既可預(yù)防和治療動物疾病、促進動物生長，又不會產(chǎn)生藥物殘留，所以越來越多的獸藥生產(chǎn)企業(yè)和畜禽養(yǎng)殖者對傳統(tǒng)中獸藥越發(fā)重視，加大生產(chǎn)和使用力度。 《中華人民共和國獸藥典》2015 版二部收載成方制劑和單味制劑共196種，如大黃芩魚散、七清敗毒顆粒、龍膽碳酸氫鈉片、魚腥草注射液等；散劑有146 種，如仁香散、止咳散、四味穿心蓮散、龍膽瀉肝散等。 中獸藥劑型比較單一，口服液、灌注劑等液體制劑只有百分之十左右，其余百分之九十左右是粉散劑。因此，劉月月等［6］、胡莉萍［7］針對中獸 藥的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀，提出了中獸藥新藥研發(fā)存在穩(wěn)定性研究不充分、劑型單一、忽略中藥使用特點等系列問題。

中藥散劑是我國臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用最早、 簡單易行、療效確切的劑型之一，具有制備簡單、易分散、起效快等優(yōu)點，但是中藥的成分非常復(fù)雜，影響中藥鑒別的因素很多。 許曾等［8］等以2015 版《中國藥典》為標(biāo)準(zhǔn)，對中藥散劑在粒度、外觀均勻度、水分、裝量差異、微生物限度等方面存在的質(zhì)量問題進行了綜合分析，微生物限度超標(biāo)為主要問題，應(yīng)從藥材、輔料及包材的管理、環(huán)境、設(shè)備清潔程度和人員操作方面嚴(yán)格管理。 金軍等［9］研究了蒙藥白蒿三味湯散劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 以鹽酸麻黃堿為指標(biāo)進行含量測定，控制成品的質(zhì)量，分離效果好，專屬性強，簡便準(zhǔn)確。黃芊等［10］建立了痔炎沖洗靈散劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 采用薄層色譜法對該散劑中中藥成分青黛和大黃進行了鑒別， 用高效液相色譜法測定了該散劑中野菊花中蒙花苷的含量， 操作簡便，重復(fù)性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。 色珍等［11］建立了藏藥股乃貢炯散劑的薄層色譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)，用TLC 法對股乃貢炯散劑中車前狀垂頭菊、 印度獐牙菜、紫檀香、芫荽果等進行薄層色譜定性鑒別，專屬性強，定性質(zhì)控可行。 從近十年文獻報道看，國內(nèi)對中藥散劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究還有待深入，而國外對中藥散劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究報道較少。

圖8 190725 樣品穿梅三黃散大黃薄層圖

圖9 190801 樣品穿梅三黃散大黃薄層圖

中獸藥穿梅三黃散外用散劑，由大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅5 味藥材組成，依據(jù)處方的組成， 采用主要藥材名稱的縮寫并結(jié)合劑型特點而命名。該品為灰黃色粉末，氣微香，味微苦，具有清熱解毒功效， 在魚病的防治中主要用于細(xì)菌性敗血癥、腸炎、爛鰓與赤皮病。在檢查項中，外觀均勻度檢查、水分含量測定檢查、最低裝量檢查等試驗結(jié)果均符合規(guī)定， 檢查項的方法均可作為穿梅三黃散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容。 穿梅三黃散組成為藥材原粉，可以建立顯微鑒別方法。該方法專屬性強且易觀察，顯微特征明顯，所以將顯微鑒別內(nèi)容進行了保留［12］。

圖10 穿梅三黃散中黃柏薄層圖譜

中獸藥穿梅三黃散的組方中，大黃為君藥，在處方中的比例大，含量高，對原標(biāo)準(zhǔn)中大黃薄層鑒別進行了復(fù)核， 筆者發(fā)現(xiàn)樣品的主斑點與對照品和對照藥材的主斑點一致，3 批的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性良好，無干擾，進行了保留。 同時，筆者參照《中華人民共和國獸藥典》2015 年版二部中黃柏藥材及含有黃柏藥材的復(fù)方制劑如意金黃散等的薄層色譜方法進行鑒別，結(jié)果顯示，對照品和3 批樣品的主斑點均不在同一位置， 薄層色譜條件有待摸索，故不建議列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。

隨著許多中藥材價格的持續(xù)升高和對顯著臨床療效的期望， 導(dǎo)致個別中獸藥生產(chǎn)企業(yè)出現(xiàn)以次充好、質(zhì)量檢測把關(guān)不嚴(yán)、違規(guī)使用替代品、用量不足及非法添加化學(xué)藥物等現(xiàn)象， 所以必須建立一個科學(xué)的符合中獸醫(yī)發(fā)展規(guī)律的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，推動中獸藥事業(yè)不斷發(fā)展壯大［13-14］。 鑒于此，積極開展針對中獸藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究， 這也是中獸藥研究與產(chǎn)業(yè)化的重要內(nèi)容， 對我國中獸醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展具有深遠影響。