集胞藻PCC6803中N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的生化表征及結(jié)構(gòu)分析

白福美 李至敏 王小琴 胡紫微 鮑玲玲 李志敏，3

（1.江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學理學院，南昌 330045；3.江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，南昌 330045）

藍藻，又名藍細菌或藍綠藻，是地球上最早出現(xiàn)的光合自養(yǎng)微生物之一，其種類繁多，分布廣泛，具有高效的光能利用率，是氧氣的主要生產(chǎn)者和生物圈不可或缺的組成者［1］。集胞藻PCC6803是1968年從淡水湖泊中分離得到的單細胞非固氮球形藍藻。相比于其他藍藻，集胞藻PCC6803不僅可以光合自養(yǎng)，還能完全依賴外部能源進行異養(yǎng)［2-3］。自1996年其全基因組序列被公布以來，集胞藻PCC6803就成為了研究藍藻的模式生物之一［4］。除此之外，集胞藻PCC6803在生物能源和環(huán)境保護上也有廣泛的應(yīng)用前景。如Gao等［5］運用同源重組的方法使集胞藻PCC6803中乙醇的日產(chǎn)量達到212 mg/L，26 d內(nèi)達到5.5 g/L，使得乙醇作為生物燃料成為了可能；Aizouq等［6］揭示了在集胞藻PCC6803中能夠產(chǎn)生甘油三酯和蠟酯，開辟了使用原核光合細胞產(chǎn)油的可能性；張兵等［7］研究發(fā)現(xiàn)集胞藻PCC6803對于砷污染的水體具有潛在的修復(fù)功能，可作為水體砷污染修復(fù)的生物材料。

三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，為細胞提供能量、還原力和合成前體。由于α-酮戊二酸脫氫酶的缺失，長期以來學術(shù)界一直認為藍藻沒有經(jīng)典的三羧酸循環(huán)途徑［8］。自Vermass研究組發(fā)現(xiàn)在集胞藻PCC6803中可以通過氧化半循環(huán)從α-酮戊二酸經(jīng)由某種途徑生成琥珀酸以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種可以使藍藻三羧酸循環(huán)變得完整的旁路，分別為：α-酮戊二酸脫羧酶/琥珀酸半醛脫氫酶途徑、乙醛酸途徑以及γ-氨基丁酸途徑。Vermaas研究組和Bryant研究組分別通過體內(nèi)及體外實驗證明了集胞藻PCC6803中slr1022基因編碼的蛋白具備編-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-AT）功能［9-10］。然而氨基酸序列分析表明slr1022基因編碼的蛋白是N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AcOAT）。此外，Bryant研究組于2016年證實slr1022基因編碼的重組蛋白體外具備AcOAT功能［10］。但是slr1022基因編碼的蛋白作為N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的生化性質(zhì)以及具體的酶動力學參數(shù)還未被表征，相關(guān)內(nèi)容還未報道。

N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是磷酸吡哆醛（Pyridoxal phosphate，PLP）依賴性酶［11］，屬于此家族的酶還有GABA-AT，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Ornithine aminotransferase OAT），2，2-二烷基甘氨酸脫羧酶等，它們大多數(shù)為二聚體或四聚體，而且其單體均由N-末端結(jié)構(gòu)域、PLP結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及C-末端結(jié)構(gòu)域組成［12］。該酶以PLP為輔因子催化N-乙酰鳥氨酸（N-acetylornithine，AcOrn）與N-乙酰谷氨酸半醛（N-acetylglutamate semialdehyde，NAGSA）的相互轉(zhuǎn)化，是精氨酸代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶。因此，研究集胞藻PCC6803中AcOAT的生化性質(zhì)對于理解集胞藻PCC6803的精氨酸代謝途徑具有重要意義。而且，大腸桿菌來源的AcOAT還可以催化賴氨酸合成途徑中N-琥珀?；?L，L-二氨基庚二酸與N-琥珀?；?L-2-氨基-6-氧庚二酸的相互轉(zhuǎn)化［13］，在細菌細胞壁的合成中起著重要作用。由于精氨酸和賴氨酸代謝在細菌中的重要作用，AcOAT也逐漸成為潛在的抑菌靶點。因此，對集胞藻PCC6803中AcOAT的生化研究也為抑菌藥物的設(shè)計提供理論依據(jù)。

本研究以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到slr1022基因，繼而將其連接到pET-28a載體，構(gòu)建得到pET28a-slr1022重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，親和層析純化后得到重組Slr1022蛋白，并對其進行酶動力學表征，同時利用生物信息學軟件對Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和模擬，旨在為進一步探索Slr1022蛋白的催化機制奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株和表達載體pET-28a均來自于本實驗室保藏，集胞藻PCC6803基因組DNA由中國科學院青島生物能源與過程研究所呂雪峰研究員實驗室提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 2×Pfu DNA聚合酶、2×Taq Mix、限制性核酸內(nèi)切酶Nde I、Xho I、T4 DNA連接酶、DNA Ladder、Protein Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司；定點突變試劑盒與Ni-NTA購于全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；所用引物和測序由上海祥音生物科技有限公司合成和完成；其余主要試劑均為分析純，均購于北京索萊寶科技有限公司。高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；層析實驗冷柜，北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；紫外-可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的PCR擴增 以集胞藻PCC6803基因組DNA為擴增模板，通過PCR擴增得到slr1022基因片段。PCR反應(yīng)體系：模板2 μL，上游引物（slr1022-F）和下游引物（slr1022-R）各1 μL（終濃度為 0.2 μmol/L），2×Pfu DNA 聚合酶 25 μL，超純水21 μL。擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.2 pET28a-slr1022重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，將PCR擴增得到的slr1022基因片段進行膠回收。使用Nde I和Xho I 對slr1022基因進行雙酶切并進行膠回收，用同樣的方法得到pET-28a線性大片段（獲得相同的黏性末端）。將酶切后的slr1022基因片段與pET-28a線性大片段（目的基因片段與載體片段的摩爾比為9∶1）借助T4 DNA連接酶于16℃水浴恒溫下過夜連接。取連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫過夜培養(yǎng)。通過菌落PCR驗證，將正確的陽性克隆培養(yǎng)后送檢測序。

1.2.3 重組Slr1022蛋白的誘導(dǎo)表達 將上述鑒定正確的陽性克隆單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，然后涂布到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落置于LB液體培養(yǎng)基中（含有50 μg/mL卡那霉素），于37℃、180 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日，以1%（V/V）的接種量接種到400 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中進行菌體擴大培養(yǎng)。待菌體生長至OD600～0.6時，冰浴30 min后，加入誘導(dǎo)劑IPTG（終濃度為0.2 mmol/L），于16℃、180 r/min 的振蕩培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)表達，24 h后離心收集菌體。使用20倍體積的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5）重懸菌體，超聲破碎細胞后，通過SDS-PAGE電泳觀察表達情況。

1.2.4 重組Slr1022蛋白的分離純化 根據(jù)上述誘導(dǎo)表達條件重新誘導(dǎo)表達1.6 L的菌液，離心收集菌體。經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5緩沖液20倍體積重懸后，置于冰水中超聲破碎細胞1 h（超聲功率5%，超聲工作時間2 s，超聲間隔時間28 s）。然后將細胞破碎液于4℃、10 000 r/min冷凍離心1 h，收集上清液。利用0.45 μm的纖維素濾膜過濾上清液，將其流穿預(yù)先用緩沖液處理的Ni-NTA。隨后用含有濃度為20 mmol/L-200 mmol/L的咪唑洗脫液進行梯度洗脫，分別收集咪唑洗脫液，用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的含量。然后合并含有高濃度高純度的目的蛋白洗脫液，將其置于透析袋中，用聚乙二醇吸水濃縮。最后將濃縮液置于透析液（含1 mmol/L DTT，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5緩沖液）中透析3次，然后用Bradford方法對目的蛋白進行定量。

1.2.5 重組Slr1022蛋白的酶動力學表征 重組Slr1022蛋白的酶動力學常數(shù)在室溫下測得。N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化底物N-乙酰鳥氨酸與α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物N-乙酰谷氨酸半醛和L-谷氨酸。L-谷氨酸在谷氨酸脫氫酶（GDH）的催化下生成α-酮戊二酸，此過程伴隨著NAD+形成NADH，NADH可在340 nm處被檢測，通過使用紫外分光光度計在340 nm處檢測NADH的生成量來衡量N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化活性［13］。反應(yīng)總體積為500 μL，反應(yīng)體系中包含100 mmol/L Tris-HCl pH 8.5緩沖液，6 mmol/L NAD+，0.05 mmol/L-2 mmol/L N-乙酰鳥氨酸，1 mmol/L α-酮戊二酸，0.1 mmol/L PLP，10 U GDH，0.26 μmol/L 重組Slr1022蛋白。使用紫外分光光度計連續(xù)測定反應(yīng)混合液在340 nm處吸光值A(chǔ)340的變化，測定不同N-乙酰鳥氨酸濃度下的初始反應(yīng)速度，利用KaleidaGraph軟件擬合到米氏方程中，計算出最大反應(yīng)速度Vmax，米氏結(jié)合常數(shù)Km以及催化速率常數(shù)kcat。測定α-酮戊二酸與重組Slr1022蛋白的結(jié)合常數(shù)時，將N-乙酰鳥氨酸的濃度固定為2 mmol/L，α-酮戊二酸的濃度為0.01 mmol/L-1 mmol/L。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 pH對重組Slr1022蛋白催化活性的影響 采用分步法檢測不同pH條件下重組Slr1022蛋白的最大初始反應(yīng)速度。為了減少緩沖液種類對酶催化效率的影響，本實驗用4種不同的緩沖液試劑配置8個不同的pH值。第一步：500 μL反應(yīng)體系包含不同的緩沖體系（分別為：pH 6.0和6.5，100 mmol/L Bis-Tris；pH 7.0和7.5，100 mmol/L HEPES；pH 8.0和 8.5，100 mmol/L Tris-HCl；pH 9.0 和 9.5，100 mmol/L CHES），1 mmol/L α-酮 戊 二 酸，2 mmol/L N-乙酰鳥氨酸，0.1 mmol/L PLP，0.24 μmol/L 重組Slr1022蛋白。將該反應(yīng)體系置于室溫下反應(yīng)10 min后，立即加熱失活重組Slr1022蛋白，12 000 r/min離心10 min后，得到上清液。第二步：500 μL反應(yīng)體系包含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.2，100 μL反應(yīng)上清液，6 mmol/L NAD+，5 U GDH［14］。使用紫外分光光度計連續(xù)測定反應(yīng)混合液在340 nm的吸光值（A340）的變化，并計算出初始反應(yīng)速度。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)分析 通過在線軟件ESPript 3.0對Slr1022蛋白及其他同源性蛋白二級結(jié)構(gòu)進行分 析（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi），同時利用在線軟件SWISS-MODEL對其三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（http：//swissmodel.expasy.org/）。最后用Procheck方法以及在線軟件Super-Pose（http：//superpose.Wishartlab.com/）對建模后結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-slr1022重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以集胞藻PCC6803基因組DNA作為模板，通過PCR擴增slr1022基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。結(jié)果表明，在約1.3 kb出現(xiàn)特異性條帶（圖1-A），該條帶與slr1022基因理論大小（1 290 bp）相匹配。同時，在目的條帶slr1022基因下方有一條明顯的非特異性擴增條帶（圖1-A）。將雙酶切后的pET-28a載體和slr1022基因片段（圖1-B）通過T4 DNA連接酶連接，之后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。采用pET-28a載體上的T7和T7 ter作為引物進行單克隆點菌落PCR，鑒定陽性克隆單菌落（圖1-C）。由于菌落PCR擴增時包括載體上約250 bp的堿基，菌落PCR產(chǎn)物堿基數(shù)比目的slr1022基因堿基數(shù)高約250 bp（圖1-B和1-C）。隨機抽取驗證正確的陽性克隆單菌落，搖瓶培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送檢測序，測序結(jié)果表明該基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中slr1022基因序列完全一致。因此，本實驗成功構(gòu)建并得到pET28a-slr1022重組質(zhì)粒。

2.2 重組Slr1022蛋白的誘導(dǎo)表達

將pET28a空載體與pET28a-slr1022表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，其菌液于16℃、180 r/min培養(yǎng)條件下經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達24 h，超聲波破碎后，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2所示。相比于泳道1中pET-28a空載體的大腸桿菌細胞破碎液，泳道4中pET28a-slr1022表達質(zhì)粒在約45 kD處有大量蛋白表達。集胞藻PCC6803中slr1022基因編碼一個含有430個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其分子量為46.5 kD，重組后帶有6xHis標簽的蛋白理論分子量為48.9 kD，與泳道4中條帶大小一致。泳道5的蛋白上清液里含有重組Slr1022蛋白，說明其在大腸桿菌BL21（DE3）中部分可溶，可進行下一步的純化。

2.3 重組Slr1022蛋白的分離純化

將含有重組Slr1022蛋白的上清液流穿事先處理的Ni-NTA，用含有20 mmol/L-200 mmol/L咪唑緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5）進行梯度洗脫。純化結(jié)果如圖3-A所示，當咪唑濃度增加至100 mmol/L時，少量的重組Slr1022蛋白被洗脫下來。當咪唑濃度增加至200 mmol/L時，大量重組Slr1022蛋白被洗脫下來。收集10-13泳道的咪唑洗脫液，于4℃下采用透析袋濃縮透析后，獲得純度大于95%的重組Slr1022蛋白（圖3-B）。用Bradford方法對濃縮透析后的目的蛋白進行濃度測定，最終得到的蛋白質(zhì)濃度為20.9 g/L，蛋白收率約為4.7 mg/g菌體。

圖1 集胞藻PCC6803中slr1022基因克隆及pET28aslr1022重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Cloning of slr1022 gene from Synechocystis sp.PCC6803 and construction of its recombinant plasmid pET28a-slr1022

2.4 重組Slr1022蛋白的酶動力學表征

圖2 重組Slr1022蛋白的誘導(dǎo)表達Fig.2 Expression of recombinant Slr1022 protein

圖3 重組Slr1022蛋白的親和層析純化結(jié)果電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of recombinant Slr1022 protein

當固定底物α-酮戊二酸濃度為1 mmo/L，改變底物N-乙酰鳥氨酸濃度時，測得的最大初始反應(yīng)速度 Vmax為 0.60 ± 0.02 μmol/（L·s），重組Slr1022蛋白與底物N-乙酰鳥氨酸的結(jié)合常數(shù)Km為（0.12±0.01）mmol/L，反應(yīng)體系中所用重組Slr1022蛋白濃度為0.26 μmol/L，由此可計算出重組Slr1022蛋白對底物N-乙酰鳥氨酸催化速率常數(shù)kcat為2.31 s-1，kcat/Km為 1.93×104mol/（L·s）（圖4-A）。當固定底物N-乙酰鳥氨酸濃度為2 mmo/L，改變底物α-酮戊二酸濃度時，測得的最大初始反應(yīng)速度Vmax為（0.65 ± 0.02）μmol/（L·s），重組 Slr1022 蛋白與底物α-酮戊二酸的結(jié)合常數(shù)Km為（0.039±0.004）mmol/L，通過計算可知重組Slr1022蛋白對底物α-酮戊二酸催化速率常數(shù)kcat為2.50 s-1，kcat/Km為6.41×104mol/（L·s）（圖4-B）。由此可知，重組Slr1022蛋白與兩個底物的結(jié)合能力均較強，催化效率較高。相比于底物N-乙酰鳥氨酸而言，重組Slr1022蛋白與另一底物α-酮戊二酸的親和性和催化效率更高。

圖4 重組Slr1022蛋白的酶動力學參數(shù)Fig.4 Kinetic profiles of recombinant Slr1022 protein

2.5 pH對重組Slr1022蛋白催化活性的影響

在pH范圍為6.5-9.5的緩沖體系中重組Slr1022蛋白表現(xiàn)出不同的催化活性。當緩沖液的體系為pH 8.5，100 mmol/L Tris-HCl時，重組Slr1022蛋白催化底物N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物N-乙酰谷氨酸半醛的活性最強。總體而言，重組Slr1022蛋白在堿性條件下行使催化功能較酸性條件下更高（圖5）。

2.6 Slr1022蛋白的結(jié)構(gòu)

圖5 pH對重組Slr1022蛋白催化活性的影響Fig.5 Effects of pH on the catalytic activity of recombinant Slr1022 protein

集胞藻PCC6803中的slr1022基因編碼的蛋白含有429個氨基酸殘基，在NCBI數(shù)據(jù)庫中該蛋白被預(yù)測為N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AcOAT），屬于磷酸吡哆醛依賴性酶家族。Slr1022蛋白和其他4個已知晶體結(jié)構(gòu)的不同來源的AcOAT的氨基酸序列比對結(jié)果，如圖6所示。Slr1022蛋白與其他來源的AcOAT氨基酸序列一致性普遍較低，而其中與海棲熱袍菌來源AcOAT（PDB ID：2E54）的序列一致性最高，為47.5%。雖然它們之間的氨基酸序列同源性較低，但其活性中心的氨基酸殘基高度保守。用在線軟件ESPript對Slr1022蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖6所示，該蛋白由13個α-螺旋、17個β-折疊及多個無規(guī)則卷曲組成。

由于Slr1022蛋白和海棲熱袍菌來源AcOAT的氨基酸序列同源性為47.5%，因此選擇海棲熱袍菌來源AcOAT的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：2E54）為模板，運用SWISS-MODEL在線軟件（http：//swiss-model.expasy.org）對Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)進行建模（圖7）。模擬出Slr1022蛋白的結(jié)構(gòu)為同源二聚體，具有兩個相等的活性位點，與大部分磷酸吡哆醛依賴性酶相似。該酶的活性中心位于晶體結(jié)構(gòu)的中心區(qū)域（圖7-A），活性中心的氨基酸殘基大部分位于無規(guī)卷曲或者α-螺旋，這與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果是一致的（圖6和圖7-B）。輔因子PLP位于活性位點口袋，被緊密地包裹在活性口袋內(nèi)。Slr1022蛋白與PLP結(jié)合的活性中心示意圖如圖7-C所示，輔因子PLP通過Schiff堿共價結(jié)合到Lys280的ε-氨基上（圖中未顯示），吡啶環(huán)上的氮原子和羥基分別與Asp251和Gln254有氫鍵作用。磷酸根上的氧二和氧三分別與主鏈上的Ser125、Gly126、Ala127組成的酰胺氮形成氫鍵，額外的氫鍵由第二亞單位Thr308的側(cè)鏈羥基提供的。

圖6 不同來源的N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列比對Fig.6 Protein sequences alignment of N-acetylornithine aminotransferases from different sources

圖7 Slr1022蛋白分子同源建模結(jié)構(gòu)Fig.7 Homologous modeling structure of Slr1022 protein

3 討論

集胞藻PCC6803中slr1022基因編碼的N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶，其具體的酶動力學參數(shù)以及生化性質(zhì)此前還未報道。本研究對Slr1022蛋白酶動力學參數(shù)進行了詳細表征，結(jié)果顯示Slr1022蛋白與底物N-乙酰鳥氨酸的結(jié)合常數(shù)Km為（0.12 ± 0.01）mmol/L，催化效率 kcat/Km為 1.93×104mol/（L·s），說明Slr1022蛋白是N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶，而且與底物N-乙酰鳥氨酸的親和力較強，催化效率較高。與大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌來源的N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶相比，Slr1022蛋白對底物N-乙酰鳥氨酸的親和力與大腸桿菌來源蛋白（0.15 mmol/L）相似，比鼠傷寒沙門氏菌來源蛋白（0.037 mmol/L）的弱，Slr1022蛋白的催化效率比大腸桿菌來源［4.0×103mol/（L·s）］高，但比鼠傷寒沙門氏菌來源［4.2×105mol/（L·s）］低［12-13］。不同的緩沖體系對 Slr1022蛋白催化活性有較大的影響。當緩沖液的體系為pH 8.5，100 mmol/L Tris-HCl時，Slr1022蛋白作為N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化活性最強。相對而言，Slr1022蛋白在堿性條件下的催化功能較酸性條件下更強。這一結(jié)果與來自于Corynebacterium crenatum［15］和 Klebsiella aerogenes［16］的 AcOAT 的酶學性質(zhì)相似，其最適pH分別為8.0和8.7，同為堿性條件下行使最佳催化活性。

盡管Slr1022蛋白與其他來源的N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列同源性不高，但是三級結(jié)構(gòu)尤其是活性中心氨基酸殘基極為保守。Mehta等［17］對氨基轉(zhuǎn)移酶進行了序列比對發(fā)現(xiàn)，在所有被研究的序列中有4個已知保守的殘基：賴氨酸、天冬氨酸、精氨酸和甘氨酸。其中活性位點賴氨酸通過醛亞胺鍵與PLP共價錨聯(lián)；天冬氨酸殘基與PLP吡啶環(huán)上的質(zhì)子化氮形成氫鍵，作為錨定位點；精氨酸殘基錨定在底物的羧基上，以促進催化周轉(zhuǎn)；甘氨酸殘基是已知的底物結(jié)合位點的屋頂，但其具體的功能研究較少。集胞藻PCC6803來源的N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶中活性位點的Lys280通過醛亞胺鍵與PLP共價連接，Asp251與PLP吡啶環(huán)上的質(zhì)子化氮形成氫鍵。此外，與PLP有氫鍵作用的氨基酸殘基還有Ser125、Gly126、Ala127、Gln254以及另一單體的Thr308。近些年來，對N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的底物結(jié)合及催化功能的研究較少，但是對同家族的OAT與GABA-AT的研究較多。其中，人來源的OAT，由于Arg413與Glu235相互作用，底物鳥氨酸的α-羧酸被Arg180識別，將鳥氨酸的δ-氨基正確地定位到進行轉(zhuǎn)移功能的輔因子PLP上［18］。這與豬來源的GABA-AT的γ-氨基丁酸類似，其中Glu270通過鹽橋與Arg445相互作用，γ-氨基丁酸的α-羧酸通過Arg192靜電保持，將γ-氨基定位到輔助因子PLP［19］。同理，集胞藻PCC6803來源的AcOAT中，也可能是由于Arg402與Glu223相互作用，底物N-乙酰鳥氨酸的α-羧酸被Arg163識別，最終將N-乙酰鳥氨酸上的δ-氨基正確地定位到PLP上。

通過不同的方法對Slr1022蛋白的結(jié)構(gòu)模型質(zhì)量進行檢測。首先在SWISS-MODEL中，Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)模型的QMEAN（模型全局質(zhì)量評估）得分為-0.24，此值接近于零，表明該模型與已知晶體結(jié)構(gòu)的相似蛋白之間具有良好的一致性；其次使用Procheck方法對得到的Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)進行驗證，結(jié)果顯示99.4%的殘基位于Ramachandran圖的允許區(qū)域內(nèi)，說明該模型的構(gòu)象符合立體化學的規(guī)則；最后使用在線軟件Super-Pose計算出Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)中Cα原子和海棲熱袍菌來源AcOAT之間的RMSD（均方根偏差）為0.23 ?，說明模擬Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)與模板的結(jié)構(gòu)重疊度非常高。綜上所述，模擬的Slr1022蛋白結(jié)構(gòu)準確性較高。

研究表明，slr1022基因編碼的蛋白還具備γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶功能，而γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶是集胞藻PCC6803中三羧酸循環(huán)GABA代謝旁路中一個的關(guān)鍵酶，是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)GABA濃度的重要蛋白［9］。GABA是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，在生物體內(nèi)具有重要的生理學功能。在細菌和植物中，GABA對于維持細胞內(nèi)的碳氮代謝平衡至關(guān)重要［20-21］。此外，GABA在植物的正常生長和抵抗脅迫過程中也發(fā)揮了重要作用［22-23］。在哺乳動物中，GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［24］。細胞內(nèi)GABA濃度過低會引起多種神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，如癲癇、帕金森癥、阿爾茲海默癥、舞動及可卡因上癮等癥［25］。因此，Slr1022蛋白作為γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶功能的催化動力學表征將是我們下一步的研究對象。

4 結(jié)論

本研究利用分子生物學手段成功構(gòu)建pET-28aslr1022重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Ni-NTA親和層析純化后獲得重組Slr1022蛋白。對Slr1022蛋白進行酶動力學表征，Slr1022蛋白與底物N-乙酰鳥氨酸的結(jié)合常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax分別是0.12 mmol/L和0.60 μmol/（L·s），與另一底物 α-酮戊二酸的 Km和Vmax分 別是 0.039 mmol/L 和 0.65 μmol/（L·s）。 此外，Slr1022蛋白在pH 8.5時催化活性最強。生物信息學分析表明Slr1022蛋白和其他來源的AcOAT在結(jié)構(gòu)上有較高的相似性，活性中心氨基酸具有高度保守性。酶學性質(zhì)和生物信息學研究表明集胞藻PCC6803來源的重組Slr1022蛋白具有N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶功能。