白斑狗魚早期發(fā)育階段的高溫耐受性分析

張鈺 海薩·艾也力汗 熱比古麗·沙吾提 時春明 張人銘

（新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，烏魯木齊 830000）

魚類屬于變溫動物，自身缺乏體溫調(diào)節(jié)能力，其體溫隨環(huán)境溫度的變化而變化，對水溫的反應(yīng)敏感且迅速，易受環(huán)境溫度影響［1］。環(huán)境溫度的變化影響魚類繁殖發(fā)育、生長存活、免疫和攝食等重要生命活動過程［2］。魚類的熱耐受性在揭示魚類溫度適應(yīng)能力和可塑性、種群地理分布以及評價水生態(tài)系統(tǒng)對潛在熱沖擊的承受能力等方面具有重要的作用［3-5］。白斑狗魚（Esox lucius）隸屬于鮭形目（Salmoniformes），狗魚亞目（Esocoidei），狗魚科（Esocidae），狗魚屬（Esox），主要分布于歐洲、亞洲和北美洲的北極圈周邊地區(qū)，我國境內(nèi)僅分布于額爾齊斯河流域，處于自然分布區(qū)域的南部邊界。

不同魚類對溫度的適應(yīng)能力不同，一般冷水性魚類的溫度適應(yīng)能力低于溫帶分布的魚類，同種魚類在不同發(fā)育階段的溫度適應(yīng)性也不同［6］。對于同一物種，早期生活階段對外界環(huán)境溫度的變化通常最為敏感，因此，相關(guān)耐熱性研究的實驗動物多選擇幼體，這樣得到的實驗結(jié)果更有生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義［7］。

魚類的熱耐受性受生物因素（物種的種間差異、遺傳特性、個體大小、年齡、性別、生活史階段和營養(yǎng)狀況等）和非生物因素（馴化溫度、馴化時間、棲息地環(huán)境和水質(zhì)等）影響。在這些因素中，馴化溫度通常被認(rèn)為是最重要的影響因素之一［3，8］。

最大臨界值（critical thermal maximum，CTmax）和起始致死溫度（upper incipient temperature，UILT50）是表達(dá)魚類熱耐受閾值的主要指標(biāo)。熱休克蛋白70（heat shock proteins70，HSP70）在熱脅迫下參與機體和細(xì)胞的耐力形成，能夠幫助生物體應(yīng)對熱脅迫。眾多研究表明，在水生動物受熱刺激后，HSP70表達(dá)量升高［9-14］。本研究以白斑狗魚仔、稚魚為實驗材料，測定熱耐受性相關(guān)閾值，以期了解其高溫耐受性，并測定HSP70基因在不同應(yīng)激溫度下在不同組織中的表達(dá)量，為白斑狗魚養(yǎng)殖和生態(tài)適應(yīng)性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年4月2 日以養(yǎng)殖于新疆水生野生動物救護中心的白斑狗魚為親本，從已性成熟的白斑狗魚群體中，選擇體重2 kg以上的雌魚、體重0.8 kg以上的雄魚，且豐滿度好、無病、無傷的個體作為親本。雌魚分2次注射催產(chǎn)素，針距為24 h，第一次注射劑量：5 μg SGnRH-A+1.5 mgVB1+3 mg DOM，第二次注射劑量：25 μg SGnRH-A+3 mg DOM；雄魚一次注射，注射劑量：5 μg SGnRH-A+1.5 mgVB1+3 mg DOM。人工催產(chǎn)3-4 d后，按照雌雄1∶2的比例挑選30組親魚人工采集精卵。在直徑為180 cm、高度為74 cm的圓形PE池中進行受精卵孵化和苗種培育，以此作為高溫耐受性實驗材料。

人工繁殖的白斑狗魚魚苗經(jīng)過2-3個月的培育，從中挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格均一的幼魚作為HSP70基因表達(dá)量測定的材料。白斑狗魚幼魚平均體長為17.7 cm±1.2 cm，平均體重為42.9 g±3.5 g。在養(yǎng)殖車間暫養(yǎng)7日，暫養(yǎng)期間按常規(guī)養(yǎng)殖每日投喂2次，連續(xù)充氣，每天換水1/3。

1.2 方法

1.2.1 白斑狗魚受精卵高溫耐受性測定 高溫耐受性實驗在長×寬×高為68 cm×58 cm×50 cm的玻璃缸中進行，控溫設(shè)備為500 W的HX-836劍客PTC加熱棒，用HACH HQ30d便攜式溶解氧分析儀測定實驗水溫和溶解氧，24 h連續(xù)充氣。

實驗用受精卵為同批次采集，完全吸水膨脹后隨機選取，每個溫度梯度約1 000粒。實驗在4個玻璃缸中進行，受精卵在離水面15 cm處固定的長×寬為10 cm×20 cm、網(wǎng)目為40目的著卵板上孵化。以人工授精自然水溫（15℃）為基點，以0.5℃/h的加溫速率達(dá)到設(shè)置水溫［（15±0.5）℃、（17±0.5）℃、（19±0.5）℃和（21±0.5）℃］。受精卵孵化結(jié)束后統(tǒng)計孵出魚苗中畸形和正常魚苗的數(shù)量。受精率統(tǒng)計：同批次受精卵在（15±1）℃的水溫中孵化至原腸中期后統(tǒng)計受精率。

1.2.2 白斑狗魚仔魚高溫耐受性測定 高溫耐受性實驗在長×寬×高為68 cm×58 cm×50 cm的玻璃缸中進行，用加熱棒控制水溫，用溶氧儀測定實驗水溫和溶解氧，24 h連續(xù)充氣。實驗魚完全失去平衡，無法正立，失去逃離能力則判定為已死亡。

溫度馴化：實驗在4個玻璃缸（規(guī)格同上）中進行，每個溫度梯度300尾上浮魚苗，馴化水溫設(shè)置為（18±0.5）℃、（21±0.5）℃、（24±0.5）℃和（27±0.5）℃，24 h充氣，每天投喂活體餌料2次，排污1次，實驗進行7 d。

急性升溫實驗：實驗在4個玻璃鋼（規(guī)格同上）中進行，水溫設(shè)置為（30±0.5）℃、（31±0.5）℃、（32±0.5）℃和（33±0.5）℃，每個玻璃缸內(nèi)放置4個長×寬×高為25 cm×40 cm×50 cm的網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱內(nèi)實驗魚苗數(shù)量為10尾，實驗開始前24 h停止投喂，觀察24 h內(nèi)魚苗的死亡數(shù)量，實驗重復(fù)3次。

緩慢升溫實驗：實驗在4個玻璃缸（規(guī)格同上）中進行，以馴化溫度為基礎(chǔ)溫度，以2℃/d的升溫速率提溫至29℃，水溫達(dá)到29℃后以1℃/d的升溫速率提溫至所有實驗魚死亡，觀察和記錄每條魚死亡的時間和死亡時的水溫。每組實驗魚苗數(shù)量為10尾，實驗重復(fù)3次。實驗期間每天投喂活體餌料2次，2 h監(jiān)測一次溶解氧和水溫。

1.2.3 不同脅迫溫度下白斑狗魚幼魚HSP70基因的表達(dá)量 將20尾白斑狗魚幼魚置于水溫27℃的水槽中24 h，用溫控加熱棒以1℃/d的升溫速率將水溫逐漸升至30、33℃，白斑狗魚幼魚在每個溫度中刺激24 h。每個溫度分別隨機選3尾白斑狗魚幼魚取其腦、鰓、心和肝浸泡于RNAstore（天根）中，-80℃保存?zhèn)溆谩嶒炘O(shè)置3個平行組和1個對照組（對照組保持水溫27℃不升溫，下同）。

1.2.4 不同脅迫時間下白斑狗魚幼魚HSP70基因的表達(dá)量 將20尾白斑狗魚幼魚置于水溫27℃的水槽中，快速提溫，升溫至30℃后，分別在0、6、9、12和24 h隨機選3尾白斑狗魚幼魚取其腦、鰓、心和肝浸泡于RNAstore（天根）中，-80℃保存?zhèn)溆?。實驗設(shè)置3個平行組和1個對照組。

1.2.5 HSP70引物序列的擴增 向樣品中加入適量Trizol，用玻璃研磨器充分研磨，提取樣品總RNA。檢測RNA的完整性，估算RNA的純度并計算RNA的濃度，將各RNA濃度均一化。以均一化后的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將所得到的cDNA模板置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根 據(jù) HSP70（GenBank登 錄 號：NC_025974.Esox lucius isolate）、β-actin的基因序列，利用Primer Premier5.0軟件結(jié)合DNAstar分析軟件及BLAST程序，設(shè)計熒光定量PCR引物。引物由上海生工公司合成，用無菌雙蒸水稀釋至10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄腥绫?所示。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Fluorescent quantitative PCR primers

熒光定量PCR在BioRad CPX96 PCR擴增儀上進行，按照TB Green Premix Ex Taq（TaKaRa）使用說明，采用嵌合熒光法進行實時定量PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq 12.5 μL，上下引物分別0.5 μL，cDNA 2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性 30 s，（95℃變性 5 s，56℃退火30 s）40個循環(huán)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 受精率為在原腸中期1 000粒受精卵中正常發(fā)育魚卵數(shù)的百分比。出苗率=正常破膜魚苗數(shù)/原腸中期正常發(fā)育魚卵數(shù)×100%。最大臨界溫度（CTmax）通過對失去平衡或致死的實驗魚的百分比進行線性回歸，再由“內(nèi)插法”得到50%個體所對應(yīng)的溫度值求得［15-16］。不同馴化溫度下，利用Probit回歸分析求得［17］白斑狗魚仔魚的起始致死溫度（UILT50）。

分子生物學(xué)實驗部分每個樣品進行3個平行PCR反應(yīng)，求出各樣品Ct值的平均值。以白斑狗魚β-actin為內(nèi)參基因，運用公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)量，公式中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組 -（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。結(jié)果用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 白斑狗魚受精卵熱耐受性研究

在水溫15-21℃范圍內(nèi)，白斑狗魚受精卵的破膜時間隨著孵化水溫的升高而縮短。水溫在15℃和17℃時，魚苗的上浮率（孵出魚苗中上浮魚苗所占的比例）無明顯的差別；當(dāng)水溫達(dá)到19℃時，上浮率下降；當(dāng)孵化水溫達(dá)到21℃時，魚苗上浮率最低，結(jié)果見表2。

2.2 白斑狗魚仔魚在不同馴化溫度下的24hUILT50

白斑狗魚仔魚在18、21、24和27℃馴化后的24hUILT50分 別 為 29.60、30.18、31.59和 32.74℃。24hUILT50值隨著馴化水溫的升高而升高，結(jié)果見圖1。

表2 不同孵化水溫對白斑狗魚仔魚上浮率的影響Table 2 Effects of different incubation water temperature on floatation rate of E.lucius fry

圖1 白斑狗魚在不同馴化溫度下的24hUILT50Fig.1 24hUILT50 of E.lucius at different acclimation temperatures

2.3 白斑狗魚仔魚的CTmax

實驗魚中一半個體失去平衡時的溫度即為CTmax。以（1±0.5）℃/d的升溫速率進行熱脅迫時，不同馴化溫度（18、21、24和27℃）下的CTmax差異不大，分別為 32.90、33.06、33.36和33.27℃。但CTmax值出現(xiàn)的時間隨著馴化溫度的升高而延長：馴化溫度為18℃時，CTmax出現(xiàn)的時間為1 152 min；馴化溫度為27℃時，CTmax出現(xiàn)時間達(dá)到了1 735 min，結(jié)果見表3。

2.4 高溫脅迫下HSP70基因在白斑狗魚各組織中的表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測白斑狗魚在不同溫度（27、30和33℃）脅迫下各組織（腦、鰓、心、肝）中HSP70基因的表達(dá)情況，以27℃的基因表達(dá)量作為基準(zhǔn)1，結(jié)果（圖2）顯示：與對照組27℃相比，白斑狗魚各組織中HSP70基因表達(dá)量在30和33℃均有所上升。在腦組織中HSP70基因的表達(dá)量隨著脅迫溫度的上升呈現(xiàn)先顯著上升（P＜0.05），后顯著下降（P＜0.05）的趨勢，在30℃時達(dá)到了最大表達(dá)量；在鰓和心臟組織中HSP70基因的表達(dá)量隨著脅迫溫度的上升呈現(xiàn)先顯著上升（P＜0.05），后下降的趨勢，33℃的表達(dá)量與30℃的表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05），在30℃時分別達(dá)到了最大表達(dá)量；在肝臟組織中HSP70基因的表達(dá)量隨著脅迫溫度的上升呈現(xiàn)逐步顯著上升（P＜0.05）的趨勢，最大表達(dá)量出現(xiàn)在33℃時。

表3 白斑狗魚仔魚在不同馴化溫度下的CTmaxTable 3 CTmax of E.lucius fry at different acclimation temperatures

2.5 高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因組織特異性表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測白斑狗魚在30和33℃高溫脅迫下各組織（腦、鰓、心和肝）中HSP70基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示：在30和33℃高溫脅迫下HSP70基因在腦、鰓、心、肝各組織中的相對表達(dá)量均存在顯著差異（P＜0.05）。在30和33℃高溫脅迫下HSP70基因的相對表達(dá)量在心臟組織中最低。在30℃高溫脅迫下HSP70基因的相對表達(dá)量在腦組織中最高。在33℃高溫脅迫下HSP70基因的相對表達(dá)量在肝臟組織中最高。

圖2 不同溫度高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因在各組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of HSP70 gene in E.lucius different tissues under different high temperature stress

圖3 相同溫度高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因在不同組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of HSP70 gene in E.lucius different tissues under the same high temperature stress

2.6 不同時間高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因在各組織中的表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測白斑狗魚在30℃高溫脅迫不同時間（0、6、9、12和24 h）后各組織（腦、鰓、心和肝）中HSP70基因的表達(dá)情況，其中以0h的基因表達(dá)量作為基準(zhǔn)1，結(jié)果如圖4所示：與對照組0 h相比，高溫脅迫6、9、12和24 h時HSP70基因表達(dá)量在腦和鰓中均高于對照組，且差異顯著（P＜0.05）；心臟組織中HSP70基因表達(dá)量在脅迫6、9、12和24 h時均高于對照組，除24 h外其他差異顯著（P＜0.05）；在肝臟組織中僅在高溫脅迫12 h時表達(dá)量略高于對照組0 h，差異不顯著（P＞0.05）。在腦、鰓、心臟組織中，隨著高溫脅迫時間的延長，HSP70基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在肝臟組織中則呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。腦和肝臟在高溫脅迫12 h時達(dá)到了HSP70基因的最大表達(dá)量；鰓和心臟在9 h時達(dá)到了最大表達(dá)量。

圖4 不同時間高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因在各組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of HSP70 gene in E.lucius different tissues under different times of high temperature stress

2.7 相同時間高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因在不同組織中的表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測白斑狗魚在相同時間（6、9、12和24 h）高溫脅迫下不同組織（腦、鰓、心和肝）中HSP70基因的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5）顯示：在30℃高溫脅迫6、9、12和24 h時HSP70基因在腦、鰓、心、肝各組織中的相對表達(dá)量均存在顯著差異（P＜0.05）。高溫脅迫6、9 h時4種組織中心臟的HSP70基因表達(dá)量最大，高溫脅迫12、24 h時腦的HSP70基因表達(dá)量最大。在高溫脅迫6、9、12和24 h時肝臟組織的HSP70基因表達(dá)量均小于同一脅迫時間下腦、鰓、心臟組織的表達(dá)量。

圖5 相同時間高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因在不同組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of HSP70 gene in E.lucius different tissues under the same time of high temperature stress

3 討論

全球氣候變暖對地球生物產(chǎn)生越來越多不良的影響，高溫對魚類的不利影響后果顯而易見［18］。耐溫性個體的生理特質(zhì)在熱適應(yīng)性上的優(yōu)勢調(diào)控，為耐溫選育工作在分子和蛋白水平上提供了理論依據(jù)［19］。高溫對白斑狗魚受精卵、仔魚及幼魚均有不同程度的影響。

3.1 白斑狗魚受精卵熱耐受性研究

水溫對魚類胚胎發(fā)育及其生存、生長和發(fā)育都有十分重要的影響，不同魚類胚胎發(fā)育要求的溫度不同［20-21］。在額爾齊斯河流域的白斑狗魚產(chǎn)卵溫度為8-15℃［22］，齊遵利等［23］認(rèn)為白斑狗魚胚胎發(fā)育的適溫范圍在14-16℃，當(dāng)水溫超過18℃時，白斑狗魚仔、稚、幼魚成活率下降。本研究結(jié)果顯示白斑狗魚受精卵在15和17℃的水溫中孵化時，魚苗上浮率無明顯的差異，而當(dāng)孵化水溫上升至19℃以上時魚苗上浮率明顯下降，這與上述研究結(jié)果基本一致。在生產(chǎn)中，將白斑狗魚受精卵孵化水溫提高至17℃，可縮短孵化時間，減少水霉病的發(fā)生，一定程度上提高成活率。

3.2 白斑狗魚仔魚在不同馴化溫度下的24hUILT50和CTmax

魚類的熱耐受性通常是通過急性或緩慢升溫實驗來研究的［3，24］。急性升溫實驗是使魚類從適應(yīng)的溫度突然暴露于實驗溫度，統(tǒng)計某一特定時間內(nèi)實驗魚類的死亡情況［25］。緩慢升溫實驗是以某種特定的升溫速率持續(xù)升溫，直至魚體達(dá)到一個臨界點［26-27］。大量的研究采用緩慢升溫的方法，這可使實驗生物有充足的時間對改變的環(huán)境溫度進行調(diào)節(jié)適應(yīng)，能更客觀地反映出實驗生物本身的熱忍耐力，建議采用 1℃/ d 的溫升速率［1］。

24hUILT50和CTmax是生物熱耐受性研究中兩個最基本的指標(biāo)。對白斑狗魚仔魚的急性升溫和緩慢升溫實驗結(jié)果表明：適當(dāng)提高白斑狗魚仔魚的馴化水溫可提高其在高溫脅迫下的24hUILT50值并推遲CTmax出現(xiàn)的時間，表明其對高溫的耐受力能夠在馴化后得以逐漸提高。

3.3 高溫脅迫下白斑狗魚HSP70基因的表達(dá)

本實驗運用熒光定量PCR檢測了30、33℃高溫脅迫下白斑狗魚各組織（腦、鰓、心和肝）中HSP70基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著溫度的上升，HSP70的表達(dá)量在腦、鰓、心臟組織中下降，而在肝臟組織中則呈現(xiàn)上升趨勢。

在30℃高溫脅迫下，白斑狗魚幼魚腦、鰓、心臟組織HSP70基因的表達(dá)量均隨著高溫脅迫時間的延長表現(xiàn)出相似的變化趨勢，即先升高后下降。說明調(diào)節(jié)熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)量是機體細(xì)胞應(yīng)對熱應(yīng)激的反應(yīng)之一［28］。通過研究發(fā)現(xiàn)，HSP70基因的表達(dá)量達(dá)到峰值的時間點有兩個，即9 h和12 h。根據(jù)這一特點，可將這3個組織分為兩組：9 h組包括鰓和心臟，12 h組包括腦。而肝臟在30℃高溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在12 h時達(dá)到峰值，但波動幅度不大。

為了綜合比較高溫脅迫對白斑狗魚幼魚影響的組織間差異，以高溫脅迫下各時間點為基準(zhǔn)，橫向比較了相同時間高溫脅迫下各組織HSP70基因表達(dá)量的差異。研究結(jié)果顯示，實驗組中腦和心臟是HSP70基因表達(dá)較豐富的組織，也是HSP70基因表達(dá)量升高最為顯著的組織。

4 結(jié)論

白斑狗魚能對高溫脅迫做出反應(yīng)。適當(dāng)提高馴化水溫，可提高高溫脅迫下白斑狗魚仔魚的24hUILT50值并推遲CTmax出現(xiàn)的時間。在不同溫度和不同時間的高溫脅迫下，白斑狗魚腦、鰓、心和肝4種組織中HSP70基因的表達(dá)量均表現(xiàn)出不同程度的變化，具有時間特異性和組織特異性，但應(yīng)答幅度不盡相同。經(jīng)過高溫馴化后，白斑狗魚提高了溫度耐受性，可能是通過HSP70參與重要調(diào)控作用。