可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子原核表達(dá)及其單克隆抗體制備

劉 沖，郜趙偉，王會(huì)平，和 婷，劉 麗，董 軻

(空軍軍醫(yī)大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 西安 710038)

B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS，又稱BAFF、TALL-1)是腫瘤壞死因子配體家族中的成員[1-2]，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞[3]。人BLyS全長(zhǎng)285個(gè)氨基酸，為Ⅱ型跨膜蛋白，有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式存在，二者生物學(xué)活性基本一致。膜結(jié)合型BLyS在蛋白酶作用下水解第132或133位氨基酸，產(chǎn)生由152個(gè)氨基酸組成的可溶性活性多肽，釋放入血即為可溶性BLyS—sBLyS[4]。作為B淋巴細(xì)胞的共刺激因子，BLyS通過(guò)與B淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合而誘導(dǎo)其增殖、分化和免疫球蛋白產(chǎn)生，在體液免疫中發(fā)揮重要作用[5-6]。研究顯示，BLyS可能在自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[7-11]。研究通過(guò)構(gòu)建sBLyS-pRSETC原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)純化獲得人sBLyS重組蛋白，并通過(guò)重組抗原免疫得到sBLyS的單克隆抗體，為后續(xù)sBLyS檢測(cè)和臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

pRSETC質(zhì)粒、大腸桿菌JM109、BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；RNAiso Plus，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，2×Taq酶、限制性內(nèi)切酶(BamH I，EcoR I)、T4DNA連接酶，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑，HAT選擇性培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司；PEG1500購(gòu)自Roche公司；BALB/c小鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pRSETC-sBLyS的構(gòu)建

取2 mL抗凝血與2 mL生理鹽水混勻，將稀釋后的血液加至分離液液面，800 r/min離心30 min，取第二層乳白色細(xì)胞層，10 mL PBS洗2次。加入1 mL RNAiso Plus混勻，提取總RNA，利用TakaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。設(shè)計(jì)sBLyS引物，引物序列上游5′-CAGGATCCGAGCCGTTCAGGGTCCAGAAG-3′，下游5′-GCGAATTCTTACAGCAG TTTCAATGCACC-3′，PCR擴(kuò)增獲得sBLyS片段。將擴(kuò)增片段與pRSETC載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。酶切鑒定并送測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆。

1.2.2 重組人sBLyS蛋白表達(dá)

挑取BL21(pRSETC-sBLyS)菌落接種到5 mL LB中培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶ 50接種到新鮮LB培養(yǎng)液中。培養(yǎng)至OD600為0.6，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。5 000 r/min離心10 min收集菌體，加入2 mL PBS，冰浴條件下超聲破碎，14 000 r/min離心10 min分別收集上清液和沉淀。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.3 重組人sBLyS蛋白純化及鑒定

將獲得菌液沉淀用8 mol/L尿素溶解并與鎳柱結(jié)合，PBS洗滌3次，利用不同濃度(50、100和200 mmol/L咪唑)的Elution buffer分別洗脫收集目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。將含目的蛋白的洗脫組分對(duì)去離子水透析過(guò)夜。收集蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，與商品化的BLyS抗體(1∶ 600稀釋)雜交，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次15 min。取出纖維素膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶ 5 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色。

1.2.4 sBLyS單克隆抗體制備

純化的目的蛋白與弗式完全佐劑按照等體積混合后充分乳化。BALB/c小鼠(6～8周)皮下多點(diǎn)注射重組蛋白50 μg/只。4周后取小鼠血清進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，選擇抗體效價(jià)高的個(gè)體繼續(xù)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每4周免疫1次，連續(xù)進(jìn)行3次免疫，第3次加強(qiáng)免疫不加佐劑腹腔注射抗原50 μg/只。3 d后取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，培養(yǎng)10～14 d后選擇體積較大的克隆進(jìn)行ELISA篩選，將分泌sBLyS抗體的雜交瘤通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行3～4次克隆化培養(yǎng)，直至所有單克隆均為陽(yáng)性。BALB/c小鼠腹腔注射滅菌石蠟油500 μL/只，兩周后腹腔注射sBLyS陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞1×106細(xì)胞/只，一周后抽取腹水。3 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.2.5 抗sBLyS單克隆抗體純化及鑒定

腹水上清液15 000 r/min離心30 min，收集上清液，緩慢加入3倍體積的醋酸鹽緩沖液，向上述溶液中逐滴加入1/40腹水體積的正辛酸，攪拌混勻10 min,10 000 r/min離心20 min,棄沉淀，測(cè)量上清液體積并加入等體積的飽和硫酸銨，將溶液輕輕混合2 h，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀并溶于10 mL PBS中，對(duì)PBS透析24 h(4 ℃)，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度，Western Blot檢測(cè)抗體特異性。

1.2.6 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

將重組抗原sBLyS以25 ng/孔包被于酶標(biāo)板中，以實(shí)驗(yàn)室保存原核表達(dá)B7H4蛋白作為陰性對(duì)照，純化抗體倍比稀釋后[分別為1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8和0.0 ng/mL(空白對(duì)照)]間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值，[(純化抗體A450-空白對(duì)照A450)/陰性對(duì)照A450]≥2.1為陽(yáng)性，陽(yáng)性抗體最低濃度即為效價(jià)。

1.2.7 HRP標(biāo)記單克隆抗體及雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)

取10 mg待標(biāo)記抗體對(duì)pH 9.4碳酸鹽緩沖液透析(Na2CO31.59 g/L，NaHCO32.93 g/L)4 h，取0.8 mL的高碘酸鈉(25.6 mg/mL)與1 mL HRP(20 mg/mL)混勻放置30 min，加入160 μL的10%乙二醇，室溫避光放置30 min，加入待標(biāo)記抗體，透析過(guò)夜，加入320 μL硼氫化鈉(5 mg/mL)混勻，避光放置2 h，加入等體積飽和硫酸銨，避光放置2 h，5 000 r/min離心30 min，棄上清液，加入2 mL的PBS溶解沉淀，對(duì)PBS透析過(guò)夜。將標(biāo)記抗體作為檢測(cè)抗體與未標(biāo)記抗體兩兩配對(duì)組合進(jìn)行ELISA雙抗體夾心實(shí)驗(yàn)，篩選包被抗體與檢測(cè)抗體的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒鑒定

利用特異性引物PCR擴(kuò)增獲得sBLyS基因片段[圖1(a)]，雙酶切鑒定表達(dá)質(zhì)粒pRSETC-sBLyS后電泳得到456 bp目的片段和2 895 bp的載體片段[(圖1(b)]，確定將測(cè)序正確的sBLyS插入pRSETC載體，說(shuō)明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

(a)The amplified sBLyS gene;(b)Enzyme digestion identification of sBLyS gene and pRSETC vector expression plasmid

2.2 重組人sBLyS蛋白表達(dá)、純化及鑒定

誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)超聲破碎后離心分離上清液和沉淀，SDS-PAGE結(jié)果顯示[圖2(a)]sBLyS蛋白以包涵體形式表達(dá)，大小為20 ku，利用鎳柱純化蛋白，Image lab(Bio-rad)軟件分析顯示[圖2(b)]純化后蛋白純度達(dá)到90%。將純化后蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，與商業(yè)化的BLyS抗體雜交，結(jié)果顯示[圖2(c)]在20 ku處出現(xiàn)特異性條帶，表明純化后的sBLyS蛋白具有免疫活性。

(a)Expression of sBLyS[1: BL21 supernatant; 2: BL21 bacterial solution precipitation; 3: BL21(pRSETC)bacterial solution supernatant; 4: BL21(pRSETC)bacterial solution precipitation; 5: BL21(pRSETC+sBLyS)bacterial solution supernatant; 6: BL21(pRSETC+sBLyS)bacterial solution precipitation];(b)Purified sBLyS protein;(c)Western Blot detection recombinant sBLyS protein[1: BL21(pRSETC)bacterial protein; 2: sBLyS purified protein]

2.3 重組人sBLyS單克隆抗體的鑒定

獲得4株sBLyS單克隆抗體(2E4、2H8、4C5和4C12)，將純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示純度較高(圖3)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)，單克隆抗體2E4、2H8、4C5和4C12具有sBLyS蛋白結(jié)合活性。

圖3 sBLyS單克隆抗體純化

圖4 sBLyS單克隆抗體蛋白免疫印跡檢測(cè)

2.4 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

間接ELISA法檢測(cè)純化抗體2H8、4C5、4C12和2E4的效價(jià)分別為10.8、20.4、26.6和9.6 ng/mL，抗體與B7H4蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性(圖5)。

圖5 4株抗人sBLyS單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

2.5 單克隆抗體配對(duì)篩選

4株抗體兩兩配對(duì)的雙抗夾心ELISA檢測(cè)顯示，使用2H8作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，HRP-4C5作為檢測(cè)抗體，具有較高的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)抗原的線性度范圍為0.4～1.6 ng/mL(R2=0.995)，見(jiàn)圖6。

圖6 sBLyS/2H8和sBLyS/4C5-HRP檢測(cè)sBLyS標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論與結(jié)論

BLyS是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，對(duì)B細(xì)胞的增殖、分化和存活具有重要調(diào)節(jié)作用[12]。sBLyS是BLyS的可溶性形式，具有BLyS的生物學(xué)功能[13]。研究顯示，sBLyS在臨床上具有兩方面的作用：sBLyS檢測(cè)可用于SLE的診斷和病情監(jiān)測(cè)；sBLyS是SLE的治療靶點(diǎn)。2011年，BLyS單克隆抗體藥物(belimumab，貝利木單抗)獲FDA批準(zhǔn)，成為過(guò)去50多年來(lái)治療SLE的首個(gè)抗體類新藥。因此，制備抗sBLyS抗體對(duì)sBLyS診斷試劑和治療藥物開(kāi)發(fā)均具有重要價(jià)值。

目前已有多個(gè)研究采用不同形式的制備方法篩選了靶向sBLyS的抗體，如徐海燕等[14]以穩(wěn)定高表達(dá)BLyS的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L-BLyS為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠，獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人BLyS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；魯戰(zhàn)平[15]運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)設(shè)計(jì)抗BLyS單鏈抗體的基因序列(VHL和MHL)，利用重疊PCR等方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，借助原核表達(dá)系統(tǒng)獲得一株可以BLyS特異性結(jié)合的VHL蛋白序列。錢尼良等[16]利用抗原抗體特異性結(jié)合，通過(guò)依次降低抗原濃度從人源單鏈抗體庫(kù)中篩選抗B細(xì)胞刺激因子的單鏈抗體基因、構(gòu)建表達(dá)載體并表達(dá)獲得一株BLyS單鏈抗體。然而目前仍無(wú)可應(yīng)用于臨床診斷的sBLyS檢測(cè)試劑盒。

本研究利用原核表達(dá)方式獲得高純度的sBLyS蛋白，通過(guò)蛋白免疫和細(xì)胞融合技術(shù)獲得4株高特異性的單克隆抗體，經(jīng)雙抗體夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)，篩選出可用于sBLyS檢測(cè)的抗體組合：2H8和HRP-4C5，為sBLyS檢測(cè)試劑盒開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)用于臨床治療試驗(yàn)的人源化抗體藥物開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。