乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物SNRPD1的研究

陳 霄, 戴曉峰

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，無錫 214122)

乳腺癌發(fā)病率高居榜首，在西方國家約占所有女性癌癥的30%[1]，也是我國婦女最常見的惡性腫瘤之一，是中國婦女第二大癌癥死因[2-3]。乳腺癌高度異質(zhì)，雖然原發(fā)病灶都是乳腺，但臨床表型各不相同，目前至少包含3種截然不同的亞型，即管腔型(luminal)、人類表皮生長因子受體2(HER2)型和三陰型(Triple Negative)[4-5]。這些亞型在臨床上表現(xiàn)不同，針對不同亞型也采取不同的治療策略。如臨床上一般采用內(nèi)分泌療法治療luminal型[6]；對HER2型乳腺癌患者常使用化療及赫賽汀靶向治療；而三陰型乳腺癌患者由于雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及HER2表達(dá)量都很低，以上療法效果均不佳，該類患者常伴隨復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，5年存活率不到15%[7]。因此，尋找新的乳腺癌診斷和治療靶點至關(guān)重要。

剪接體是一個具有環(huán)形纖芯復(fù)雜結(jié)構(gòu)的核糖核蛋白(RNP)，由7個基因(SNRPB、SNRPD1、SNRPD2、SNRPD3、SNRPE、SNRPF和SNRPG)編碼的蛋白質(zhì)組成，主要負(fù)責(zé)將前體RNA剪接成mRNA[8]，準(zhǔn)確的剪接對確保正常的細(xì)胞功能(如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲)至關(guān)重要。有研究表明：剪接體基因的表達(dá)與癌癥的發(fā)生有關(guān)，且SNRPD1在肺癌和卵巢癌中顯著高表達(dá)[9]，另有學(xué)者提議可使用SNRPD1表達(dá)高低來區(qū)分具有高度侵襲性的癌癥[10]。此外，SNRPD1也被提議作為多種癌癥的潛在治療靶點，如黑素瘤、肺癌[11-12]。

近十年來，隨著微陣列、二代測序等高通量技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)被廣泛應(yīng)用于癌癥機(jī)理研究[13-14]。本研究利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實驗研究SNRPD1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為乳腺癌藥物研發(fā)，尤其是惡性程度較高的三陰性乳腺癌的藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 數(shù)據(jù)下載

美國的癌癥基因組譜圖(TCGA)數(shù)據(jù)庫儲存了各種癌癥的多組學(xué)數(shù)據(jù)與臨床隨訪數(shù)據(jù)。通過TCGA 數(shù)據(jù)庫(http://cancergenome.nih.gov)下載了乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)(2020 年2月)。該數(shù)據(jù)集包含998個乳腺癌患者腫瘤樣本，28 218個基因的轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)，其中102位患者在隨訪中死亡。在數(shù)據(jù)處理前，數(shù)據(jù)通過log2歸一化獲得正態(tài)分布的表達(dá)值。通過quantile-quantile plot，將數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布進(jìn)行對比，作為正態(tài)性的檢驗。

1.1.2 生存分析

使用KMplot在線工具(http://kmplot.com/analysis/)分析GSE42568數(shù)據(jù)集中SNRPD1的表達(dá)對乳腺癌病人10年總體生存率(Overall survival)和復(fù)發(fā)生存率(Relapse free survival)的影響。GSE42568數(shù)據(jù)集包含了來自104位乳腺癌病人癌癥樣本與17個正常乳腺樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，使用cox回歸模型以及l(fā)og-rank檢驗檢驗?zāi)Ｐ偷娘@著性。

1.1.3 功能分析與聚類

通過對表達(dá)量與SNRPD1偶聯(lián)的基因功能富集分析，可以尋找SNRPD1所調(diào)控的生物學(xué)過程?；蛳嚓P(guān)性分析主要使用Pearson相關(guān)系數(shù)表征，公式如下:

使用Pearson相關(guān)性系數(shù)篩選與SNRPD1相關(guān)的基因，以R2>0.5且P<0.01作為篩選閾值。對篩選到的SNRPD1相關(guān)基因，使用基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，其數(shù)學(xué)模型是利用超幾何分布和Fisher精確檢驗衡量給定基因集中各生物學(xué)通路占比的統(tǒng)計學(xué)顯著性。超幾何分布公式如下：

該公式描述了給定所有N個基因中有M個基因?qū)儆谀惩?，若隨機(jī)挑取n個基因，其中k個基因?qū)儆谠撏返母怕省?/p>

此外，使用非監(jiān)督的層級聚類功能觀測目標(biāo)生物學(xué)功能是否與病人的臨床表型相關(guān)聯(lián)。以上數(shù)據(jù)分析，使用編程語言R撰寫腳本，其中使用到程序包“ClusterProfiler”[15]“org.Hs.db.eg”[16]以及“pheatmap”[17]，多重假設(shè)檢驗使用Benjamini-Hochberg法校準(zhǔn)P值[18]。P<0.01作為統(tǒng)計檢驗顯著性的閾值。

1.2 細(xì)胞生物學(xué)實驗

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實驗使用乳腺癌細(xì)胞系MCF7，培養(yǎng)基使用添加了10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)使用的胰蛋白酶購自Gibco公司；D-PBS、HEPES(吉諾生物)；胰島素(Insulin)購自江蘇省無錫市第四人民醫(yī)院。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染

靶向SNRPD1兩個siRNA 由吉瑪公司進(jìn)行合成。轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞在孔板中以約50%的融合度鋪板。轉(zhuǎn)染時，按產(chǎn)品操作手冊，在Opti-MEM培養(yǎng)基中依次加入siRNA和lipo3000試劑，混合后靜置15～20 min，然后與孔板中的細(xì)胞混合。兩條siRNA同時轉(zhuǎn)染，各占總siRNA用量的50%。表1中列出了為SNRPD1設(shè)計的siRNA。

三是最終形成體系化的財務(wù)管理模式，為企業(yè)的運營和發(fā)展提供客觀數(shù)據(jù)和資料。大數(shù)據(jù)時代下數(shù)據(jù)的挖掘、加工、利用、處理和分析等成為企業(yè)財務(wù)管理工作的基礎(chǔ)，以上工作流程也將成為財務(wù)管理構(gòu)建的新模式和運作機(jī)制。模式的核心在于“數(shù)據(jù)的搜集、整理和分析”，即“數(shù)據(jù)說話”為企業(yè)財務(wù)管理決策提供基礎(chǔ)，財務(wù)管理報告中的各項決定和規(guī)劃能夠進(jìn)一步指導(dǎo)企業(yè)運作和發(fā)展提供服務(wù)。

表1 研究所用siRNA

1.2.3 實時熒光定量PCR

基因轉(zhuǎn)錄水平測定使用實時熒光定量PCR(qPCR)。siRNA轉(zhuǎn)染24 h后提取總RNA(TRIzol)，使用PrimeScriptRT逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用qPCR試劑盒(康為生物)以及羅氏LightCycler 480qPCR儀進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。相對表達(dá)水平使用2-ΔΔCt方法計算。使用t檢驗評估統(tǒng)計學(xué)顯著性。所有t檢驗顯著性如下標(biāo)識：*表示P<0.05,**表示0.01

表2 研究所用qPCR引物

1.2.4 免疫印跡

siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白。使用BCA分析試劑盒(Tiangen)測算蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE膠上分離，并使用BioRad 濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，在室溫5%脫脂牛奶中封閉1 h，使用一抗在4 ℃過夜孵育蛋白，次日在二抗下孵育2 h。使用High-sigECL Western Blot試劑(天能)顯色，并使用BioRad成像設(shè)備檢測信號。本實驗使用JNK(c Jun N terminal kinase 1)總蛋白抗體，購自proteintech(Catalog number: 51151-1-AP)。

1.2.5 增殖測定

轉(zhuǎn)染后48 h，使用CKK-8(Dojindo)測量細(xì)胞增殖，并在37 ℃ 孵育2 h后，使用EZ Read 800酶標(biāo)儀(Biochrom)檢測發(fā)光。使用t檢驗評估細(xì)胞數(shù)量變化的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 SNRPD1參與細(xì)胞生物學(xué)過程分析預(yù)測

2.1.1SNRPD1在不同乳腺癌亞型中的差異表達(dá)和預(yù)后分析

通過對來自TCGA乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，并利用方差分析表征SNRPD1在不同類型中差異表達(dá)的顯著性，結(jié)果顯示：基因SNRPD1在腫瘤組織中的表達(dá)量顯著高于正常組織[圖1(a)，P<2×10-16]。針對不同亞型乳腺癌的SNRPD1表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，SNRPD1在惡性程度最高的三陰性中表達(dá)量最高，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于表達(dá)量最低的Luminal型[圖1(b)，P<2×10-16]。結(jié)果表明：SNRPD1不僅在腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)高低還可能與癌癥的惡性程度相關(guān)。為了驗證SNRPD1對病人的預(yù)后影響，使用MKplot與cox回歸模型進(jìn)行生存分析，分析結(jié)果表明：無論是使用病人整體生存率還是非復(fù)發(fā)率作為指標(biāo)，SNRPD1的高表達(dá)都預(yù)示著更差的預(yù)后，即更低的生存概率和更高的腫瘤復(fù)發(fā)概率[圖1(c)和(d)]。以上結(jié)果表明，SNRPD1的高表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生和惡化中起到關(guān)鍵作用，但其作用機(jī)制尚不明確。

(a)SNRPD1在正常組織和癌癥組織中的表達(dá)量；(b)SNRPD1在不同乳腺癌亞型中的表達(dá)量；(c)不同SNRPD1表達(dá)水平的病人的整體生存率；(d)不同SNRPD1表達(dá)水平的病人的癌癥非復(fù)發(fā)率

表達(dá)量相關(guān)聯(lián)的基因往往在功能上有一定的關(guān)聯(lián)。為了挖掘SNRPD1參與的細(xì)胞生物過程，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，尋找與SNRPD1表達(dá)相關(guān)的基因，即SNRPD1共表達(dá)基因，再通過功能富集分析尋找SNRPD1共表達(dá)基因參與的細(xì)胞通路。通過計算SNRPD1與所有基因的皮爾森相關(guān)性，可以獲得SNRPD1相關(guān)性表達(dá)譜，呈正態(tài)分布[圖2(a)]。通過相關(guān)性表達(dá)譜，篩選共得到442個相關(guān)基因(343個基因正相關(guān)，99個基因負(fù)相關(guān))。

GO富集分析表明：SNRPD1共表達(dá)基因除了主要參與剪接體功能外，還參與了細(xì)胞核分裂和有絲分裂等細(xì)胞生物學(xué)過程[圖2(b)]。不僅如此，通過GO富集分析，將GO富集到的通路基于相似性構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，獲得了GO功能網(wǎng)絡(luò)。該GO功能網(wǎng)絡(luò)表明，SNRPD1共表達(dá)GO網(wǎng)絡(luò)主要有兩個簇：RNA加工和有絲分裂。推測SNRPD1除了負(fù)責(zé)RNA加工，還可能與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)[圖2(c)]。

(a)所有基因與SNRPD1的表達(dá)相關(guān)性數(shù)據(jù)分布，橫坐標(biāo)表示相關(guān)性大小，縱坐標(biāo)表示基因數(shù)量；(b)SNRPD1共表達(dá)基因的通路富集結(jié)果，橫坐標(biāo)表示給定的基因集合中該通路的基因的比例，顏色表示顯示性檢驗的P值；(c)SNRPD1共表達(dá)基因的GO富集網(wǎng)絡(luò)

為了確認(rèn)有絲分裂基因在乳腺癌中的作用，利用TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了無監(jiān)督層級聚類分析。分析結(jié)果顯示：對有絲分裂基因的聚類能區(qū)分三陰型乳腺癌與luminal乳腺癌，且這些基因在三陰型乳腺癌中高表達(dá)[圖3(a)]。此外，也觀察到HER2亞型的患者也聚成了一簇，且部分表達(dá)量較高。以此推測，SNRPD1可能參與細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)而在癌癥的發(fā)生發(fā)展以及遷移惡化中起作用。最后，比較了細(xì)胞參與有絲分裂的基因的表達(dá)量與所有基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，細(xì)胞參與有絲分裂的基因在乳腺癌中高表達(dá)[圖3(b)，P<2×10-16]。

(a)細(xì)胞有絲分裂基因表達(dá)量對乳腺癌病人進(jìn)行無監(jiān)督層級聚類，不同亞型的病人使用不同顏色標(biāo)出，各基因表達(dá)量使用紅藍(lán)色表示；(b)有絲分裂基因相對于所有基因的表達(dá)量

2.2 SNRPD1在細(xì)胞增殖中的作用

2.2.1SNRPD1敲降對乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響

通過siRNA技術(shù)以達(dá)到在乳腺癌細(xì)胞系MCF7中敲降SNRPD1的目的。被敲降的細(xì)胞稱為siSNRPD1細(xì)胞。通過qPCR驗證，siSNRPD1細(xì)胞中基因SNRPD1的轉(zhuǎn)錄水平被敲降至對照組的30%以下[圖4(a)，P=0.001 6]。使用細(xì)胞增殖實驗檢測基因敲降對細(xì)胞增殖的影響。增殖實驗顯示，SNRPD1敲降導(dǎo)致siSNRPD1細(xì)胞增殖能力下降至對照組的60%[圖4(b)，P=0.001 3]。

(a)利用qPCR驗證SNRPD1敲降效果;(b)細(xì)胞增殖實驗

2.2.2SNRPD1敲降對細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白質(zhì)的影響

JNK為細(xì)胞增殖的標(biāo)志分子，根據(jù)前期相關(guān)性分析，TCGA病人癌組織中JNK與SNRPD1的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)[圖5(a)，P=3.3e-05]。使用JNK作為細(xì)胞增殖標(biāo)志分子，從分子層面驗證SNRPD1對細(xì)胞增殖的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，siSNRPD1細(xì)胞的JNK蛋白質(zhì)表達(dá)量下降到原來的約50%[圖5(c)和(d)，P=0.004 1]。qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，siSNRPD1細(xì)胞中的JNK基因轉(zhuǎn)錄量下降到原來的70%[圖5(b)，P=0.008 5]，與蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果吻合。

(a)SNRPD1與JNK轉(zhuǎn)錄組散點圖；(b)JNK的qPCR定量分析結(jié)果；(c)JNK蛋白免疫印跡結(jié)果;(d)JNK蛋白免疫印跡結(jié)果定量分析

3 結(jié)語

通過數(shù)據(jù)分析和實驗驗證，確定了SNRPD1與乳腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)聯(lián)。預(yù)測SNRPD1與細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖相關(guān)，其高表達(dá)可預(yù)示乳腺癌預(yù)后較差以及惡性程度更高，并通過實驗證明，抑制SNRPD1表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖下降，且調(diào)控細(xì)胞增殖的JNK蛋白表達(dá)下降。SNRPD1低表達(dá)抑制細(xì)胞的快速增殖，并可能進(jìn)一步參與癌癥的發(fā)生和惡化過程。

然而，SNRPD1如何影響細(xì)胞的增殖，以及JNK是否介導(dǎo)SNRPD1引起細(xì)胞增殖變化仍需要進(jìn)一步探究。此外，研究前期找到的SNRPD1還與細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制相關(guān)，雖這些過程都與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，但仍需要進(jìn)一步驗證這些變化過程。有研究證明，SNRPD1在肺癌、卵巢癌和黑素瘤中差異表達(dá)，然而其對病人的具體作用方式并沒報道。實驗首次提出將SNRPD1的作用與細(xì)胞增殖聯(lián)系起來，并使用差異表達(dá)解釋乳腺癌亞型的不同臨床結(jié)果,暗示SNRPD1作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物及其在臨床治療中的潛力，尤其是針對增殖較快的三陰型乳腺癌，并為其他類型癌癥的治療提供借鑒。