不同工藝的決明子提取液對微生物生長抑制作用的研究

劉維兵 楊 林 包曉瑋

1.青島德慧海洋生物科技有限公司 山東青島 266000 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 新疆烏魯木齊 830000

決明子是豆科植物決明Cassia obrtusifolia L.或小決明C.toraL.的成熟干燥種子。決明子是我國歷史悠久的藥用植物，最早《神農(nóng)本草經(jīng)》將決明子列為上品。決明子味甘、苦、咸，性微寒，善入肝、腎、大腸經(jīng)，具有清肝明目、潤腸通便的功效。決明子具有較好的抗菌、抗氧化、抗衰老等療效。決明子抑制微生物的生長具有顯著效果，是國家衛(wèi)生部公布的藥食同源的物質(zhì)之一[1]。

決明子的乙醇提取物及氯仿提取物對多種細(xì)菌均有抑制作用。程玲鈴[2](2005)等用中藥決明子的乙醇提取物及氯仿提取物對核盤菌、鐮刀菌、柑桔綠霉、棉花炭疽病菌等10余種植物病原菌進行抑菌活性篩選研究，結(jié)果表明決明子對植物真菌病原的抑制作用強于對植物細(xì)菌病原菌。決明子粗提液對棉花炭疽病菌的抑菌率達(dá)62%，對油菜菌核病菌的抑菌率達(dá)53%，均有比較好的利用前景。

本論文圍繞決明子不同提取物對食源性致病菌的抑菌效果展開研究，為開發(fā)一款安全、新型環(huán)保的植物抗菌劑替代一部分抗生素的使用等提供一定可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備、儀器

1.1.1 材料

決明子，青島德慧海洋生物科技有限公司；

比濁管，南京建成生物工程研究所；

魔芋粉，青島市即墨區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品中心批發(fā)市場；

沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單抱桿菌、單增李斯特菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌，上海保藏生物技術(shù)中心；

YPD肉湯、YPD培養(yǎng)基、LB肉湯、LB培養(yǎng)基，上海保藏生物技術(shù)中心。

1.1.2 設(shè)備、儀器

電子天平LE2002E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

紫外-可見分光光度計TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

立式高壓滅菌器LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；

生物安全柜HR40-IIA2，青島海爾特種電器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000E，上海耀特儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品液的制備

取魔芋粉2g，加198mL無菌水、制成魔芋粉混懸液，漩渦震蕩器震蕩均勻，備用；取決明子粉5g，加蒸餾水95mL，漩渦震蕩器震蕩均勻，60℃靜止浸提3h備用；取決明子粉5g加氯仿95mL，82℃冷凝回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20mL左右，過濾，備用；取決明子粉5g，加95%乙醇95mL，82℃冷凝回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20mL左右，過濾，備用；取決明子粉5g，加蒸餾水95mL，100℃回流提取，文火濃縮至混懸液總質(zhì)量20g，備用。

1.2.2 菌種的活化和傳代培養(yǎng)

單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單抱桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌：將斜面保藏的菌種，接種在Luria-Bertani液態(tài)培養(yǎng)基中進行活化，在36℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。后將菌液在Luria-Bertani培養(yǎng)基上畫線，在36℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3d。菌種經(jīng)過冷凍后，生長延遲期較長，故需經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)，菌液待用[3～5]。

白色念珠菌：采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基糖(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium Agar)培養(yǎng)基，其他活化、培養(yǎng)方法同單增李斯特菌等。

1.2.3 決明子對魔芋粉中菌落總數(shù)的抑制

配制好平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)高壓蒸汽消毒滅菌后，倒入平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，每皿約15～20mL，作為空白組A；在無菌操作下倒入魔粉混懸液1mL于干熱滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)，再倒入冷卻至50℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，即培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的厚度約2～2.5mm作為對照組B；在無菌操作下倒入魔粉混懸液1mL于干熱滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)，再倒入冷卻至50℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，加入1mL乙醇溶液(95%)，作為乙醇陽性對照組C；無菌操作下倒入魔粉混懸液1mL于干熱滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)，再倒入冷卻至50℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，后加入1mL氯仿溶液，作為氯仿陽性對照組D；決明子氯仿提取液E組、決明子乙醇提取液F組、決明子蒸餾水提取液G組、決明子粉蒸餾水浸提液H組，置于36℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h。觀察不同方法提取出的決明子提取液，對魔芋粉中菌落總數(shù)生長的抑制作用。

抑制率計算公式=(對照組菌落總數(shù)-試驗組菌落總數(shù))/對照組菌落總數(shù)

1.2.4 決明子對食源性致病菌的抑制

將菌液用比濁管定量至濃度為106CFU，配制好LB、YPD培養(yǎng)基，經(jīng)高壓蒸汽消毒滅菌后，定量分裝到20mL提前滅菌處理的無菌試管中，待溫度冷卻至50℃左右加入100uL濃度為106CFU菌液，迅速倒入無菌平板中，待培養(yǎng)基凝固后放入牛津杯，每個平板三個平行，分別向牛津杯中加入200uL 95%乙醇作為A組、氯仿B組、蒸餾水C組、決明子乙醇提取物D組、決明子氯仿提取物E組、決明子蒸餾水提取物F組、蒸餾水浸提物G組，置于36℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h。觀察不同方法提取出的決明子提取液，在不同食源性致病菌上抑菌圈大小[6～9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實驗均進行3次重復(fù)操作，所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行顯著性分析，處理結(jié)果均以X±SD表示，圖表制作利用Excel 2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 決明子不同提取液對魔芋粉中菌落總數(shù)抑制結(jié)果

對照組魔芋粉混懸液菌落總數(shù)為6.9×103CFU，乙醇提取液、蒸餾水浸提液對微生物的抑制率為100.0%，氯仿提取液對微生物的抑制率為82.9%，乙醇對照組對微生物的生長基本無抑制作用，氯仿對照組對微生物的抑制率為11.9%，水提取液對微生物的抑制率為58.0%。不同提取液對魔芋粉中菌落總數(shù)的抑制率見表1。

表1 不同提取液對魔芋粉中菌落總數(shù)的抑制率

2.2 決明子不同提取液對食源性致病菌抑菌圈大小試驗結(jié)果

如表2所示，乙醇對照組、氯仿對照組、蒸餾水對照組，對7種食源性基本無抑菌效果，決明子乙醇提取液對食源性致病菌的抑菌效果顯著高于決明子氯仿提取液、蒸餾水提取液、蒸餾水浸提液，枯草芽孢桿菌對決明子乙醇提取液高度敏感(抑菌圈直徑>16mm)。

表2 不同提取液對食源性致病菌抑菌效果Table 2 Antibacterial effects of different extracts on food-borne pathogens

3 結(jié)論與討論

蒸餾水提取液對微生物生長的抑制效果不如氯仿、乙醇提取液，而蒸餾水浸提液的抑菌效果卻能與乙醇提取液抑菌效果達(dá)到一致，均為100%，原因可能是高溫破壞了決明子中活性成分(生物堿、游離蒽醌、苷類等)的分子構(gòu)造，進而導(dǎo)致抑菌能力下降，而乙醇的沸點為78℃，很好的保護了決明子中有效抑菌成分，使抑菌活性達(dá)到100%；氯仿提取液的抑菌能力不如乙醇提取液，說明氯仿能溶解萃取出決明子中有效抑菌物質(zhì)的能力，不如乙醇。

決明子乙醇提取液對食源性致病菌的抑制效果，顯著高于其它3種提取工藝提取出的決明子提取液，蒸餾水高溫提取出的決明子提取液，只對枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌效果，且抑菌效果較差，對其他致病菌基本無抑菌效果，這也說明高溫會破壞決明子中有效抑菌活性物質(zhì)，其它3種工藝萃取出的決明子提取液，只對金黃色葡萄球菌、銅綠假單抱桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌具有抑菌效果，說明決明子提取液只對革蘭氏陽性菌具有抑菌作用，而對革蘭氏陰性菌、真菌等抑菌效果較差。