高糖狀態(tài)通過(guò)WIF1-Wnt/β-catenin通路調(diào)控結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖

林志玲?黎潔瑤?閔筱輝?許稷豪?于濤?陳其奎

【摘要】目的 分析高糖狀態(tài)對(duì)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并探討Wnt抑制因子1（WIF1）通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路影響高糖狀態(tài)下結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制。方法 用不同濃度的D-葡萄糖處理結(jié)腸腫瘤細(xì)胞株SW620細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白免疫印跡法測(cè)定增殖相關(guān)基因的表達(dá)，行細(xì)胞增殖活性檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，用細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，采用qPCR和蛋白免疫印跡法測(cè)定WIF1和β-catenin的表達(dá)。轉(zhuǎn)染siRNA和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒調(diào)控WIF1的表達(dá)后，檢測(cè)WIF1對(duì)SW620細(xì)胞增殖能力和β-catenin表達(dá)水平的影響。結(jié)果 隨著糖濃度的增加，SW620細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（P均< 0.05），WIF1的表達(dá)下降而β-catenin的表達(dá)增高（P均< 0.05）。下調(diào)WIF1的表達(dá)，SW620細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)且β-catenin的表達(dá)增高（P均< 0.05），而過(guò)表達(dá)WIF1后，SW620細(xì)胞的增殖能力受到抑制且β-catenin的表達(dá)下降（P均< 0.05）。結(jié)論 高糖狀態(tài)下WIF1表達(dá)的下降，可能通過(guò)活化Wnt/β-catenin通路促進(jìn)高糖狀態(tài)下結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】高糖;結(jié)腸腫瘤;Wnt抑制因子1;β-連環(huán)蛋白;增殖

High glucose regulates the proliferation of colon cancer cells through the WIF1-Wnt/β-catenin signaling pathway Lin Zhiling， Li Jieyao， Min Xiaohui， Xu Jihao， Yu Tao， Chen Qikui. Department of Gastroenterology， Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Chen Qikui， E-mail： qkchen2015@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of high glucose on the proliferation of colon cancer cells， and investigate the mechanism of the effect of Wnt inhibitory factor 1 （WIF1） on the proliferation of colon cancer cells under high glucose state through the Wnt/β-catenin signaling pathway. Methods Colon cancer cell line SW620 cells were treated with different doses of D-glucose. The expressions of proliferation-associated mRNA and protein were measured by real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR） and Western blot. The proliferation ability of SW620 cells was measured by cell proliferation assay， cell counting assay and colony formation assay. The expression levels of WIF1 and β-catenin were detected by qPCR and Western blot. After regulating the expression of WIF1 by the transfection with siRNA and over-expressed plasmid， the effect of WIF1 upon the proliferation ability and the expression of β-catenin in SW620 cells was evaluated. Results Along with the increase in glucose concentration， the proliferation ability of SW620 cells was significantly increased， the expression of WIF1 was remarkably down-regulated and the expression of β-catenin was significantly up-regulated （all P < 0.05）. The proliferation ability of SW620 cells was considerably increased and the expression of β-catenin was significantly up-regulated after down-regulating the WIF1 expression （all P < 0.05）. However， after the over-expression of WIF1， cell proliferation ability was significantly inhibited and the expression of β-catenin was remarkably down-regulated （all P < 0.05）. Conclusion Down-regulation of WIF1 expression under high glucose state may promote the proliferation of colon cancer cells under high glucose state via the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway.

【Key words】High glucose;Colon cancer;Wnt inhibitory factor 1;β-catenin;Proliferation

近年來(lái)糖尿病和結(jié)腸癌的發(fā)病率逐漸上升，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)糖尿病可增加結(jié)腸腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但糖尿病增加結(jié)腸腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚不明確[1-2]。Wnt抑制因子1（WIF1）是由WIF1基因編碼的一種分泌性蛋白，是Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路的抑制因子，其與Wnt蛋白直接結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞膜上的卷曲蛋白受體家族將信號(hào)傳至胞內(nèi)，引起通路關(guān)鍵分子β-catenin的磷酸化，促進(jìn)β-catenin的降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[3]。有研究顯示W(wǎng)IF1具有抑制腫瘤發(fā)生的作用[4]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和成體組織再生中發(fā)揮重要作用。既往研究顯示，合并糖尿病的結(jié)腸癌患者的腫瘤細(xì)胞存在Wnt信號(hào)通路的異常激活，糖尿病患者的正常結(jié)腸上皮出現(xiàn)β-catenin的升高，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與其抑制因子WIF1可能參與增加糖尿病患者發(fā)生結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。因此，本研究擬探討高糖狀態(tài)對(duì)WIF1表達(dá)的影響，及WIF1影響高糖狀態(tài)下結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì) 胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620細(xì)胞由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心惠贈(zèng)。將細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、主要試劑

DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)），細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8（APExBIO，美國(guó)），TRIzol Reagent（Invitrogen， 美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit（Takara， 日本），qPCR SYBR

TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takara，日本），RIPA

細(xì)胞裂解液（康為世紀(jì)，中國(guó)），BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)， 中國(guó)），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法ECL試劑盒（Millipore， 美國(guó)），WIF1多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國(guó)），β-catenin多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國(guó)），PCNA多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國(guó)），Ki67多克隆抗體（abclonal， 中國(guó)），LGR5多克隆抗體（abclonal， 中國(guó)），GAPDH多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國(guó)），羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology， 美國(guó)），Lipofectamin 3000（Invitrogen， 美國(guó)），WIF1 siRNA（銳博生物， 中國(guó)），pcDNA3.1-WIF1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（艾基生物， 中 國(guó)）。

三、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將SW620細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的普通DMEM完全培養(yǎng)基。將SW620細(xì)胞接種于6孔板中，待SW620細(xì)胞貼壁后更換成無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后分別用不同糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，并將其分為3組：5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇（低糖組，LG組），20 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L甘露醇（正常糖組，NG組），30 mmol/L葡萄糖（高糖組，HG組）。每日換液，72 h后收取樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

收集各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次，用TRIzol按說(shuō)明書(shū)提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后，將RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒體系合成cDNA。按qPCR試劑盒配制反應(yīng)體系，在Roche LightCycler 480 qPCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到各樣本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.蛋白免疫印跡法

于冰上收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），混勻后于冰上裂解30 min，離心后收取上清，按BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液后，于100℃加熱5 min使蛋白變性，蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后，將其電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜在5%脫脂牛奶中于室溫下封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（1∶1000）于4℃搖床過(guò)夜，加入與一抗對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000）于室溫孵育1 h。用ECL法曝光目的條帶，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

4.細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

將SW620細(xì)胞按每孔3000個(gè)接種于96孔板中，按分組處理繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24、48、72 h在每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育2 h，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度，用吸光度表示增殖活性。對(duì)增殖相關(guān)基因增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Ki67、富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白偶聯(lián)受體（LGR5）進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測(cè)。

5.細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

將SW620細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種于12孔板中，按分組處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，分別于0、24、48、72 h用胰酶消化制備成細(xì)胞懸液，按1∶1加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，滴加至血球計(jì)數(shù)板中，于顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

6.細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將SW620細(xì)胞按每孔1000個(gè)接種于6孔板中，按分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)14 d，每3 d換液1次。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌1次，加入0.1%結(jié)晶紫溶液，染色30 min，再用清水洗滌數(shù)次后晾干，于顯微鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算克隆形成率。

討論

越來(lái)越多的研究顯示糖尿病可增加結(jié)腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而其中分子機(jī)制尚未明確。本研究組探討了不同糖濃度對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620細(xì)胞的增殖、WIF1的表達(dá)、Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵因子表達(dá)的影響，以及進(jìn)一步研究分子調(diào)控和相關(guān)機(jī)制，結(jié)果顯示在高糖狀態(tài)下WIF1表達(dá)的下降，可能通過(guò)活化Wnt/β-catenin通路來(lái)促進(jìn)高糖狀態(tài)下結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖。

以往的研究顯示高糖可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖[7]。本研究證實(shí)了SW620細(xì)胞的增殖能力隨著糖濃度的升高而增加。同時(shí)，隨著糖濃度的升高，WIF1的表達(dá)逐漸下降，而β-catenin的表達(dá)則逐漸增高。既往研究顯示合并糖尿病的結(jié)腸癌患者中存在Wnt信號(hào)通路的異常激活[5]。本研究結(jié)果顯示，高糖抑制WIF1的表達(dá)和促進(jìn)Wnt/β-catenin通路的活性可能與高糖促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。多項(xiàng)研究顯示，WIF1在各系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)降低，如口腔內(nèi)膜鱗狀細(xì)胞癌、鼻咽癌等，WIF1在各腫瘤中表達(dá)降低可能與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[8-10]。同時(shí)有研究者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)WIF1可以抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，說(shuō)明WIF1可能是影響結(jié)腸腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑癌基因[11]。Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、成體組織的再生和腫瘤干細(xì)胞特性等中均起著至關(guān)重要的作用，Wnt/β-catenin通路中某些基因的突變或表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致其異?；罨烧T發(fā)癌癥[12-14]。WIF1通過(guò)與Wnt蛋白直接結(jié)合，抑制Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Fzd受體作用，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞質(zhì)中的Axin、APC和GSK3β形成毀滅復(fù)合體，導(dǎo)致β-catenin磷酸化而后降解，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受抑制，抑制細(xì)胞增殖[15]。本研究顯示，WIF1的表達(dá)與SW620細(xì)胞的增殖能力和β-catenin的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明WIF1通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路的活性抑制細(xì)胞增殖。以上研究結(jié)果提示，高糖抑制WIF1的表達(dá)，WIF1表達(dá)的下降進(jìn)一步通過(guò)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞在高糖狀態(tài)下的增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，高糖下調(diào)WIF1的表達(dá)，使WIF1對(duì)Wnt/β-catenin通路的抑制作用受阻，從而促進(jìn)高糖狀態(tài)下結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)現(xiàn)或可為糖尿病促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生提供理論基礎(chǔ)和新的干預(yù)靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-02-13）

（本文編輯：洪悅民）