維生素甲酸在中長(zhǎng)波紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚光老化模型中的作用

李敏 趙飛

(河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450003)

長(zhǎng)期紫外線照射會(huì)引發(fā)人皮膚組織光老化，出現(xiàn)皮膚增厚、粗糙、色素沉積、皮革樣外觀等癥狀〔1〕；皮膚膠原纖維含量減少、變性是光老化的特征性組織學(xué)表現(xiàn)〔2〕。維生素甲酸是目前皮膚光老化治療的主要藥物，可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)分泌來改善患者臨床癥狀〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，維生素甲酸類藥物在體內(nèi)通過與維生素甲酸受體、維生素甲酸X受體特異性結(jié)合而發(fā)揮藥理學(xué)作用〔4〕。但維生素甲酸抑制光老化皮膚MMPs分泌是否與維生素甲酸受體機(jī)制有關(guān)仍未明確。本研究旨在探討維生素甲酸抑制皮膚光老化的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性ICR小鼠90只，體重22～26 g，購(gòu)于北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，批號(hào)：SCXK(京)2014-0003。飼養(yǎng)溫度22～24℃、濕度50%～60%，12 h節(jié)律光照，自由飲食、進(jìn)食。

1.2主要試劑 反式維生素甲酸、維生素甲酸受體拮抗劑、維生素甲酸受體激動(dòng)劑、維生素甲酸X受體拮抗劑、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑均購(gòu)于上海仁捷生物科技有限公司；兔抗人MMP3多克隆抗體、兔抗人MMP13多克隆抗體購(gòu)于北京奧維亞生物有限公司。

1.3皮膚光老化模型建立 隨機(jī)將90只小鼠分為模型80只，正常對(duì)照10只進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)。模型組第2周起開始進(jìn)行長(zhǎng)波紫外線(UVA)、短波紫外線(UVB)聯(lián)合照射，照射距離30 cm，每周照射3次，隔日進(jìn)行；照射時(shí)間在第2、3、4周分別為30 min/次、45 min/次、60 min/次，第5周以后為90 min/次，共照射12 w，每次照射前剔去小鼠背部毛發(fā)。正常對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)12 w。

1.4分組與處理 將造模的80只小鼠隨機(jī)分為：模型組、維生素甲酸組、維生素甲酸受體拮抗劑組(維生素甲酸+維生素甲酸受體拮抗劑)、維生素甲酸X受體拮抗劑組(維生素甲酸+維生素甲酸X受體拮抗劑)、維生素甲酸受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組，每組10只。其中維生素甲酸的給藥劑量為2 mg/kg；維生素甲酸受體拮抗劑、維生素甲酸X受體拮抗劑的給藥劑量為4 mmol/kg；激動(dòng)劑的給藥劑量為1.6 mmol/kg；溶劑為乙醇∶丙二醇(7∶3)，連續(xù)給藥8 w，每周給藥5次，在小鼠背部中央皮膚上外用100 μl，給藥后避光；模型組僅給予乙醇丙二醇溶劑。

1.5標(biāo)本采集與制備 末次給藥后，在全麻狀態(tài)下取小鼠背部皮膚，分為2份，其中一份液氮速凍后-80℃保存，另一份多聚甲醛固定后常規(guī)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6Western印跡檢測(cè) 取部分凍存的皮膚組織標(biāo)本，RIPA提取總蛋白，定量后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕法轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加兔抗人MMP3多克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人MMP13多克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)，室溫下靜置2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，避光顯影，分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。

1.7標(biāo)本組織中膠原蛋白含量檢測(cè) 取小鼠皮膚組織30 mg，堿水解-光度法測(cè)定羥脯氨酸含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×7.46。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組皮膚組織病理學(xué)改變情況 正常對(duì)照組小鼠表皮結(jié)構(gòu)完整，厚度正常。模型組小鼠皮膚增厚，表皮不規(guī)則，膠原束斷裂、卷曲、排列不均。維生素甲酸組、維生素甲酸X受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑組與模型組相比表皮厚度和真皮膠原纖維明顯改善，以真皮上部改善最明顯。維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組與模型組相比無明顯改善。見圖1。

圖1 各組皮膚組織病理學(xué)改變(HE，×200)

2.2維生素甲酸通過維生素甲酸受體對(duì)光老化皮膚MMP3和MMP13表達(dá)的影響 模型組MMP3、MMP13蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，維生素甲酸組明顯低于模型組(P<0.05)，維生素甲酸受體拮抗劑組明顯高于維生素甲酸組(P<0.05)；維生素甲酸X受體拮抗劑組與維生素甲酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表1。

1～5：正常對(duì)照組、模型組、維生素甲酸組、維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸X受體拮抗劑組圖2 各組MMP3和MMP13蛋白表達(dá)Western印跡電泳

表1 各組MMP3和MMP13蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3維生素甲酸受體激動(dòng)劑對(duì)光老化皮膚MMP3和MMP13表達(dá)的影響 維生素甲酸受體激動(dòng)劑組MMP3、MMP13蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組明顯高于維生素甲酸受體激動(dòng)劑組(P<0.05)。見圖3，表2。

1～4:正常對(duì)照組、模型組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組圖3 各組MMP3和MMP13 Western印跡電泳

表2 各組MMP3和MMP13蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4維生素甲酸X受體激動(dòng)劑對(duì)光老化皮膚MMP3和MMP13表達(dá)的影響 維生素甲酸X受體激動(dòng)劑組MMP3、MMP13蛋白表達(dá)水平與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組與維生素甲酸受體激動(dòng)劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，表3。

1～4：正常對(duì)照組、模型組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組圖4 各組MMP3和MMP13的Western blot電泳圖

表3 各組MMP3和MMP13蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5各組小鼠皮膚組織中膠原蛋白含量比較 正常對(duì)照組、模型組、維生素甲酸組、維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸X受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑組、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組膠原蛋白含量依次為：(20.82±2.16)、(13.95±2.41)、(17.73±1.85)、(13.50±1.76)、(17.47±1.90)、(15.93±2.11)、(13.19±1.61)、(12.82±1.66)、(12.76±1.86)μg/mg。維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑聯(lián)合拮抗劑組明顯低于維生素甲酸組、維生素甲酸受體激動(dòng)劑組(P<0.05)。維生素甲酸X受體激動(dòng)劑組與維生素甲酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

真皮膠原纖維變性、含量減少是皮膚光老化的主要病理學(xué)表現(xiàn)〔5〕。紫外線反復(fù)照射可抑制前膠原蛋白合成，加速降解膠原蛋白，膠原蛋白含量減少引發(fā)真皮層中的膠原纖維出現(xiàn)病理性改變〔6〕。MMPs作為具有生物活性的胞外基質(zhì)降解酶，參與皮膚光老化的發(fā)生與發(fā)展〔7〕。相關(guān)研究顯示，人體皮膚長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外線下會(huì)提升MMP1、MMP3表達(dá)水平，MMP1能夠促進(jìn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白裂解〔8〕，同時(shí)MMP3也具有明顯的膠原蛋白降解活性〔9〕。基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，MPP13可增強(qiáng)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原裂解活性〔10〕。

維生素甲酸能夠抑制光老化皮膚組織中的MMPs表達(dá)，降低膠原纖維降解率，緩解光老化皮膚的發(fā)生與發(fā)展〔11〕。維生素甲酸類藥物在體內(nèi)主要通過與維生素甲酸受體、維生素甲酸X受體相互結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮藥理學(xué)作用。但維生素甲酸受體在維生素甲酸抑制皮膚光老化MMPs表達(dá)中的作用鮮有報(bào)道。本研究顯示，維生素甲酸能夠明顯抑制小鼠光老化皮膚組織中MMP3、MMP13表達(dá)水平，抑制膠原降解，提升皮膚中膠原蛋白含量，改善皮膚組織學(xué)表現(xiàn)；維生素甲酸受體拮抗劑可逆轉(zhuǎn)維生素甲酸對(duì)小鼠光老化皮膚MMP3、MMP13表達(dá)的抑制作用，加速膠原降解，皮膚中膠原含量明顯低于維生素甲酸組，而維生素甲酸X受體拮抗劑無上述作用。提示維生素甲酸可通過維生素甲酸受體降低皮膚組織中MMP3、MMP13蛋白表達(dá)，抑制光老化皮膚的膠原降解。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究使用維生素甲酸受體、維生素甲酸X受體激動(dòng)劑、拮抗劑進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，維生素甲酸受體激動(dòng)劑可明顯下調(diào)光老化皮膚組織中的MMP3、MMP13表達(dá)水平，與維生素甲酸具有類似作用，但維生素甲酸X受體激動(dòng)劑無上述作用。與此同時(shí)，維生素甲酸受體拮抗劑可抑制激動(dòng)劑的改善作用。提示維生素甲酸受體參與維生素甲酸類藥物發(fā)揮藥效學(xué)作用，但維生素甲酸X受體未見明顯作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了維生素甲酸可通過維生素甲酸受體抑制光老化皮膚組織中MMP3、MMP13蛋白表達(dá)，但維生素甲酸受體包含α、β、γ3種亞型〔12〕，具體涉及哪種亞型仍需進(jìn)一步研究。