阿霉素致大鼠慢性心力衰竭模型建立

張譯心 紀(jì)鳳蘭 王鑫 王曉 劉博 溫富春 丁濤 徐惠波

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院)

慢性心力衰竭(CHF)常見于各種心血管疾病的終末期階段，是一種具有高患病率和高死亡率的臨床常見病〔1〕。阿霉素(ADR)屬于蒽醌類藥物，是臨床常用的一種高效腫瘤化療藥物，長(zhǎng)期使用可損害機(jī)體的心肌組織，具有嚴(yán)重的心臟毒性，引發(fā)劑量依賴性不可逆的心肌損害和CHF〔2～4〕，因此ADR致大鼠CHF動(dòng)物模型已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究中常采用的動(dòng)物模型。雖然該模型應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但方法不一，多種多樣，也無統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)通過采用ADR不同的造模方法，建立穩(wěn)定的大鼠CHF模型，并以治療CHF的陽性藥芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)造模結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，旨在建立一種穩(wěn)定可重復(fù)的ADR誘導(dǎo)CHF動(dòng)物模型，并規(guī)范模型評(píng)價(jià)指標(biāo)，為該模型在藥理學(xué)研究中更好應(yīng)用提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 ADR：批號(hào)：1703E3、1909E1，由深圳萬樂藥業(yè)有限公司經(jīng)銷；芪藶強(qiáng)心膠囊：批號(hào)：A1807004，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司經(jīng)銷。

注射用生理鹽水購(gòu)自吉林康乃爾藥業(yè)有限公司；烏來糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肝素鈉購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醛購(gòu)自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；甲醇購(gòu)自北京化工廠；二喹啉甲酸(BCA)總蛋白定量測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；B型利鈉肽(BNP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自RD公司；RIPA、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液、Tris液、TBST均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；GAPDH(G-9)IgG1、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2(C-2)IgG1、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(B-9)IgG2b、Caspase-3(C-2)IgG2a均購(gòu)自Santa Cruz公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2動(dòng)物 健康7周齡SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄均可，體重(220±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司〔SCXK(吉)-2016-0003〕，飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)研究院屏蔽環(huán)境動(dòng)物室〔SYXK(吉)2015-0009〕，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，倫理審批號(hào)JLSZKYDWLL2019-001。

1.3儀器 多導(dǎo)生物記錄儀(AD儀器公司產(chǎn)品)，酶標(biāo)儀(BioTek儀器有限產(chǎn)品)，紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司產(chǎn)品)，高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品)，六一電泳儀(北京市六一儀器廠產(chǎn)品)，Imager(Ultra-Violet Products Ltd產(chǎn)品)，石蠟切片機(jī)及石蠟包埋機(jī)(德國(guó) Leica 公司產(chǎn)品)，光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus 公司產(chǎn)品)，圖像分析系統(tǒng)(日本NIKON公司產(chǎn)品)。

1.4造模與分組 Wistar大鼠182只，試驗(yàn)分3批進(jìn)行，每批均分空白組、模型組、陽性藥組，隨機(jī)分組，共計(jì)9組。具體分組、造模及給藥方法如下：

第一批，ADR注射量為1.5 mg/kg：試驗(yàn)分為空白組(A組)12只，模型組(B組)24只，陽性藥組(C組)24只。試驗(yàn)開始后B組、C組腹腔注射ADR 1.5 mg/kg，2次/w，連續(xù)9 w，A組同時(shí)腹腔注射同體積生理鹽水10 ml/kg；C組灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊0.33 g/kg，1次/d，連續(xù)63 d，A組和B組同時(shí)灌胃同體積蒸餾水10 ml/kg。

第二批，ADR注射量為2.0 mg/kg：試驗(yàn)分為空白組(D組)12只，模型組(E組)25只，陽性藥組(F組)24只。試驗(yàn)開始后E組、F組腹腔注射ADR 2.0 mg/kg，1次/w，連續(xù)13 w，D組同時(shí)腹腔注射同體積生理鹽水10 ml/kg；C組灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊0.33 g/kg，1次/d，連續(xù)91 d，D組、E組同時(shí)灌胃同體積蒸餾水10 ml/kg。

第三批，ADR注射量為3.0 mg/kg：試驗(yàn)分為空白組(G組)13只，模型組(H組)24只，陽性藥組(I組)24只。試驗(yàn)開始后H組、I組腹腔注射ADR 3.0 mg/kg，1次/w，連續(xù)8 w，G組同時(shí)腹腔注射同體積生理鹽水10 ml/kg；I組灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊0.33 g/kg，1次/d，連續(xù)56 d，G組、H組同時(shí)灌胃同體積蒸餾水10 ml/kg。

1.5存活率計(jì)算 各組記錄初始動(dòng)物數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束后記錄各組存活動(dòng)物數(shù)，計(jì)算各組動(dòng)物的存活率。

1.6心功能檢測(cè) 末次給藥后30 min，各組隨機(jī)選取10只大鼠，稱重，腹腔注射烏來糖(1.2 g/kg、10 ml/kg)麻醉，仰臥固定，右側(cè)頸總動(dòng)脈插管經(jīng)壓力換能器接生理記錄儀，記錄心率、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)后，繼續(xù)將導(dǎo)管插至左心室，記錄左心室收縮末期壓力(LVESP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dt max)。

1.7心臟指數(shù)測(cè)定 心功能檢測(cè)結(jié)束后，去除腹腔內(nèi)腹水后再次稱重，計(jì)算腹水重量=體重-去腹水體重；取心臟，去除非心肌組織，洗凈血液，濾紙吸干水分，稱全心重量。計(jì)算心臟指數(shù)(HW/BW)=全心重量/體重。

1.8心肌組織中BNP含量檢測(cè) 每組隨機(jī)選取10只大鼠，腹主動(dòng)脈取血，經(jīng)3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測(cè)血清中BNP的含量。

1.9心肌組織蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 每組隨機(jī)選取若干只大鼠，摘取心臟，稱重后，將部分心肌組織固定于10%甲醛溶液中，HE染色，光鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，并測(cè)量心室壁厚度。

1.10心肌組織凋亡率檢測(cè) 各組隨機(jī)選取8只大鼠，摘取心臟，將部分心肌組織固定于10%甲醛溶液中，進(jìn)行TUNEL染色，觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡率。

1.11心肌組織中相關(guān)蛋白的檢測(cè) 動(dòng)物采血后，取部分心肌組織，-80℃保存?zhèn)溆?，通過Western印跡分析心肌組織中凋亡信號(hào)通路蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2表達(dá)的變化。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ADR致大鼠CHF對(duì)存活率的影響 A組存活率為100%(12/12)，D組存活率為91.67%(11/12)，G組存活率為100%(13/13)；C組存活率為62.5%(15/24)，F(xiàn)組存活率為62.5%(15/24)，I組存活率為91.7%(22/24)；B組存活率為70.83%(17/24)，E組存活率為68.00%(17/25)，H組存活率為87.50%(21/24)，即模型組存活率：H組>B組>E組，說明3.0 mg/kg劑量組模型的制備動(dòng)物存活率較高。

2.2ADR致大鼠CHF對(duì)心功能的影響 ADR 1.5 mg/kg組：與A組相比，B組心率、SBP顯著下降，-dp/dt max有降低趨勢(shì)，LVEDP顯著升高(P<0.01)，LVESP、+dp/dt max顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組心率、SBP、LVESP均顯著升高(P<0.01；P<0.05)。

ADR 2.0 mg/kg組：與D組相比，E組SBP和LVESP顯著降低(P<0.01；P<0.05)，LVEDP顯著升高(P<0.05)，DBP有升高的趨勢(shì)，±dp/dt max有降低趨勢(shì)(P>0.05)；與E組相比，F(xiàn)組SBP、DBP、LVESP、±dp/dt max均顯著升高(P<0.01，P<0.05)，LVEDP顯著降低(P<0.05)。

ADR 3.0 mg/kg組：與G組相比，H組LVESP、±dp/dt max均顯著降低(P<0.01；P<0.05)，心率有降低的趨勢(shì)，DBP和LVEDP有升高的趨勢(shì)(P>0.05)；與H組相比，I組心率和LVESP顯著增加(P<0.05)，±dp/dt max增加(P<0.05)，見表1。

表1 ADR致大鼠CHF對(duì)心功能的影響

2.3ADR致大鼠CHF對(duì)心臟重量及心臟指數(shù)的影響 ADR 1.5 mg/kg組：與A組相比，B組體重和心臟重量均顯著降低(P<0.01)，腹水重量和心臟指數(shù)有增加的趨勢(shì)(P>0.05)；與B組相比，C組體重有升高的趨勢(shì)(P>0.05)。ADR 2.0 mg/kg組：與D組相比，E組體重和心臟重量顯著降低(P<0.01)，腹水重量顯著增加(P<0.01)；與E組比較，F(xiàn)組大鼠體重有降低的趨勢(shì)(P>0.05)。ADR 3.0 mg/kg組：與G組相比，H組體重、心臟重量、心臟指數(shù)均顯著降低(P<0.01；P<0.05)，腹水重量顯著增加(P<0.01)；與H組比較，I組大鼠體重、心臟重量及心臟指數(shù)均顯著增加(P<0.01；P<0.05)，腹水重量顯著降低(P<0.01)，見表2。

2.4ADR致大鼠CHF對(duì)血清BNP含量的影響 ADR 1.5 mg/kg組：空白組與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，與模型組比較，陽性藥組BNP含量顯著降低(P<0.01)。ADR 2.0 mg/kg組：與空白組比較，模型組BNP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組BNP含量顯著降低(P<0.05)。ADR 3.0 mg/kg組：與空白組比較，模型組BNP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組BNP含量顯著降低(P<0.01)，見表3。

表2 ADR致大鼠CHF對(duì)心臟指數(shù)的影響

表3 ADR致大鼠CHF對(duì)血清BNP含量及左心室壁厚度的影響

2.5ADR致大鼠CHF對(duì)左心室壁厚度的影響 ADR 1.5 mg/kg組：與空白組比較，模型組左心室壁厚度降低(P<0.05)。ADR 2.0 mg/kg組：與空白組比較，模型組左心室壁厚度顯著降低(P<0.01)；ADR 3.0 mg/kg組：與空白組比較，模型組左心室壁厚度顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組左心室壁厚度顯著增加(P<0.05)，見表3。

2.6ADR致大鼠CHF對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示：ADR 1.5 mg/kg組：A組心肌細(xì)胞排列緊密，心肌間質(zhì)可見輕微水腫、疏松；B組心肌細(xì)胞體積變小，左心室壁厚度明顯變薄，心肌間質(zhì)可見水腫；C組大鼠左心室壁變薄，心肌間質(zhì)疏松區(qū)域減少。ADR 2.0 mg/kg組：D組可見局部少量心肌間血管充血；E組左心室壁變薄，心肌間質(zhì)可見明顯水腫、疏松；F組大鼠左心室壁變薄，心肌間質(zhì)水腫、疏松程度減輕。ADR 3.0 mg/kg組：G組心肌纖維排列規(guī)整，細(xì)胞核多位于肌纖維中央，心肌間質(zhì)未見滲出、未見水腫，心肌內(nèi)血管未見擴(kuò)張充血，心內(nèi)膜、外膜亦未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；H組心肌細(xì)胞變性、水腫；心肌間質(zhì)間隙擴(kuò)大；心肌纖維染色不均；左心室壁厚度明顯變薄，左心室腔變大；乳頭肌處心肌纖維變性明顯，呈典型的心肌病改變，心外膜可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；I組心肌典型的心肌病改變，心肌細(xì)胞變性、水腫；心肌間質(zhì)間隙擴(kuò)大；血管擴(kuò)張，心肌纖維染色不均的程度有所減輕，見圖1。

2.7ADR致大鼠CHF對(duì)心肌組織凋亡指數(shù)的影響 分別與各自空白組比較，ADR 1.5、2.0、3.0 mg/kg模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著升高(P<0.01;P<0.05)；與模型組比較，1.5 mg/kg陽性藥組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)有降低趨勢(shì)(P>0.05)，2.0、3.0 mg/kg陽性藥組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

TUNEL染色顯示，ADR 1.5 mg/kg組：A組凋亡細(xì)胞數(shù)較少，凋亡陽性細(xì)胞呈深棕色；B組深棕色凋亡陽性細(xì)胞散在分布在未凋亡的心肌細(xì)胞間；C組可見極少見的呈深棕黃色陽性染色的細(xì)胞分布在正常心肌細(xì)胞間，觀察視野內(nèi)凋亡陽性染色細(xì)胞數(shù)量極少；ADR 2.0 mg/kg組：D組散在分布的深棕色凋亡陽性細(xì)胞數(shù)較少；E組可觀察到視野內(nèi)呈深棕色凋亡陽性細(xì)胞分布增加；F組可見數(shù)個(gè)呈深棕黃色陽性染色的細(xì)胞分布，觀察視野內(nèi)凋亡陽性染色細(xì)胞數(shù)量減少；ADR 3.0 mg/kg組：G組可見極少見的呈深棕黃色陽性染色的細(xì)胞分布在正常心肌細(xì)胞間，觀察視野內(nèi)凋亡陽性染色細(xì)胞數(shù)量極少；H組可見數(shù)個(gè)呈深棕黃色陽性染色的細(xì)胞分布，觀察視野內(nèi)凋亡陽性染色細(xì)胞數(shù)量增加；I組可見數(shù)個(gè)呈深棕黃色陽性染色的細(xì)胞分布，觀察視野內(nèi)凋亡陽性染色細(xì)胞數(shù)量減少，見表4、圖2。

表4 ADR致大鼠CHF對(duì)心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

圖2 阿霉素致大鼠CHF對(duì)心肌組織凋亡的影響(TUNEL染色，×200)

2.8ADR致大鼠CHF對(duì)心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ADR 1.5 mg/kg組，與A組比較，B組Bcl-2顯著降低，Bax、Caspase-3顯著升高(均P<0.05)；與B組比較，C組Bcl-2組顯著升高(P<0.01)，Bax顯著降低(P<0.05)。ADR 2.0 mg/kg組，與D組比較，E組Bcl-2顯著降低，Bax、Caspase-3顯著升高(均P<0.01)；與E組比較，F(xiàn)組Bcl-2顯著升高(P<0.01)，Bax顯著降低(P<0.05)。ADR 3.0 mg/kg組，與G組比較，H組Bax、Caspase-3顯著升高，Bcl-2顯著降低(均P<0.05)；與H組比較，I組Bcl-2顯著升高(P<0.01)，Bax顯著降低(P<0.05)，Caspase-3有降低趨勢(shì)(P>0.05)，見圖3、表5。

與空白組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組相比：3)P<0.05，4)P<0.01圖3 ADR致大鼠CHF對(duì)心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 ADR致大鼠CHF對(duì)心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

CHF是指由各種致病因素導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，表現(xiàn)為心臟負(fù)荷過重，心肌舒縮力下降，導(dǎo)致心排血量不足，引起一系列臨床癥狀和體征的復(fù)雜綜合征〔5～7〕。研究顯示，心室重構(gòu)是CHF發(fā)生的基本機(jī)制。心室重構(gòu)是由于心肌容量或壓力負(fù)荷過重或心肌損傷，使心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而直接導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能減退、心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡等一系列病理生理變化〔8〕。ADR與心肌具有較強(qiáng)的親和性，可直接損傷心臟的結(jié)構(gòu)和功能，累計(jì)用藥可誘發(fā)心肌細(xì)胞壞死、凋亡等，導(dǎo)致心室重構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)CHF〔9～11〕。

研究表明，CHF發(fā)生的基本機(jī)制是心臟收縮和舒張功能下降，±dp/dt max是反映心肌收縮和舒張的最大速度，+dp/dt max主要受心率及前后負(fù)荷的影響，反映左心室的收縮功能，當(dāng)心肌的收縮能力下降時(shí)，+dp/dt max值也下降；-dp/dt max反映心肌舒張時(shí)心肌纖維收縮成分延長(zhǎng)的最大速率，反映左心室的舒張功能，當(dāng)心肌的舒張能力下降時(shí)，-dp/dt max值也下降〔12，13〕。LVESP是反映左心室內(nèi)壓上升時(shí)達(dá)到的最大值，LVEDP反映舒張末期的左心室內(nèi)壓，心力衰竭時(shí)由于心臟收縮性減弱，LVESP降低；由于舒張功能障礙，心室順應(yīng)性降低，導(dǎo)致左心室舒張末期容積擴(kuò)大，LVEDP升高。因此，常用LVESP、LVEDP和±dp/dt max作為評(píng)價(jià)心肌舒縮功能的重要指標(biāo)。

BNP是在心室容積擴(kuò)張和壓力負(fù)荷增加時(shí)，由心肌細(xì)胞合成并從心室釋放的一種神經(jīng)激素。研究表明，心力衰竭時(shí)BNP分泌迅速增加，從而延緩心臟前負(fù)荷的增加；也可通過充盈心室減輕體液負(fù)荷和靜脈充血，進(jìn)一步調(diào)節(jié)心功能障礙。由于BNP分泌增加是在心功能障礙時(shí)突發(fā)的，不受其他因素干擾，因此由血漿BNP水平反映心功能狀態(tài)更具代表性，常作為評(píng)價(jià)心力衰竭的金指標(biāo)〔14，15〕。

心力衰竭導(dǎo)致心室重構(gòu)，心肌細(xì)胞大量丟失，細(xì)胞凋亡是心室重構(gòu)致心肌細(xì)胞丟失表達(dá)的主要形式。心力衰竭時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，分泌物質(zhì)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞減少，導(dǎo)致心肌收縮力下降，心功能發(fā)生障礙，進(jìn)一步加重心力衰竭〔16～18〕。心力衰竭時(shí)由于心臟負(fù)荷加重，心室內(nèi)壓力增大導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒張變細(xì)，心室壁變??；心肌細(xì)胞凋亡使細(xì)胞數(shù)量減少，可進(jìn)一步促進(jìn)心室壁變薄。心力衰竭時(shí)，由膠原、纖維黏連蛋白等組成的心肌細(xì)胞外基質(zhì)被破壞，出現(xiàn)心肌纖維化〔19，20〕。

綜上，ADR誘導(dǎo)CHF可導(dǎo)致心室重構(gòu)，心臟舒縮功能下降，心重指數(shù)下降，BNP含量升高，左心室壁變薄，出現(xiàn)明顯的心肌纖維化改變及心肌細(xì)胞凋亡。3.0 mg/kg ADR誘導(dǎo)CHF模型組各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果較1.5 mg/kg、2.0 mg/kg模型組結(jié)果更為顯著，并且造模周期短，動(dòng)物存活率較高。因此，采用腹腔注射ADR 3.0 mg/kg，1次/w，連續(xù)8 w的方法制備大鼠CHF動(dòng)物模型較理想。