幽門(mén)螺桿菌鞭毛蛋白A單克隆抗體的制備與鑒定

邱 席，劉 偉，莊睿娟，陳亞瓊，鄧晨希，王團(tuán)老*

(1.廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102；2.廈門(mén)大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361102)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori)在人類(lèi)胃中定植，與胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍以及胃癌密切相關(guān)[1-2].1994年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其列為第一類(lèi)致癌因子[3].然而，目前臨床上對(duì)于幽門(mén)螺桿菌的診斷方法并不理想，本研究旨在探索更好的診斷方法.

幽門(mén)螺桿菌的鞭毛伸出菌體外約2.5 μm，鞭毛自細(xì)胞膜長(zhǎng)出后，游離于細(xì)胞膜外；伸出菌體外的鞭毛主要為鞭毛鞘包裹的鞭毛絲，由鞭毛蛋白A(FlaA)和FlaB二聚體組成，其中FlaA是主要的鞭毛蛋白[4].FlaA核苷酸序列高度保守，不同幽門(mén)螺桿菌的FlaA核苷酸序列同源性可達(dá)90%以上[5],且具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性.綜上特點(diǎn)，本研究選擇幽門(mén)螺桿菌的FlaA為抗原，通過(guò)傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備其單克隆抗體(mAb)，并對(duì)其特性進(jìn)行鑒定，以期為建立新的幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ、XholⅠ和T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21菌株、骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14和載體PET-28a為本實(shí)驗(yàn)室保存；6～8周齡雌性BALB/c小鼠(SPF級(jí))由廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基蝶呤和聚乙二醇(PEG1500)購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清和小牛血清購(gòu)自Hyclone公司；RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素購(gòu)自Biosharp公司，考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自麥克林公司，尿素購(gòu)自西隴化工公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗原的制備

1) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ncbi.nlm.nih.gov)中查到的HpFlaA基因序列，設(shè)計(jì)引物并委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成.按照KOD(TOYOBO公司)高保真PCR體系50 μL，引物10 mmol,幽門(mén)螺桿菌基因組DNA(ATCC)模板200 ng.PCR程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s,68 ℃ 45 s,72 ℃ 10 min,35個(gè)循環(huán)4 ℃ 10 min.通過(guò)SacⅠ與XholⅠ雙位點(diǎn)酶切，并通過(guò)T4連接酶將目的片段與載體PET-28a重組.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落并擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；并用SacⅠ與XholⅠ限制性?xún)?nèi)切酶，37 ℃ 酶切1 h,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn).

2) 蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，挑取單菌落置于5 mL卡那霉素抗性培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)后離心收菌；十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后考馬斯亮藍(lán)染色，脫色.挑陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增至2瓶800 mL卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)后8 000 r/min、4 ℃離心10 min收菌并超聲破碎(功率200 W，工作3 s，間歇6 s，共10 min)；取上清和少許沉淀經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白表達(dá)位置.用2 mol/L尿素洗滌沉淀2次，然后用8 mol/L 尿素溶解，4 ℃梯度透析復(fù)性.

1.2.2 mAb的制備

1) 小鼠的免疫：將純化的HpFlaA融合蛋白與等體積的FCA充分乳化，BALB/c小鼠四肢及背部皮下多點(diǎn)注射融合蛋白50 μg/只.2周后進(jìn)行第2次免疫，將純化的HpFlaA融合蛋白與等體積的FIA充分混合，四肢及背部皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫，2周后第3次免疫，同第2次.第3次免疫后7～10 d,眼球取血,通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清抗體效價(jià).于融合前3 d選擇抗體滴度最高的1只小鼠脾臟加強(qiáng)免疫100 μg.

2) 細(xì)胞融合：在融合之前準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞，取1只13 d左右小鼠的胸腺和1只8周小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞.脾臟免疫3 d后，無(wú)菌取脾臟制成單細(xì)胞懸液，與生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SP2/0-Ag14細(xì)胞融合，采用常規(guī)PEG促融合方法，融合后的細(xì)胞接種于96孔板，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

3) ELISA和雜交瘤細(xì)胞的篩選：將0.5 μg/mL的抗原包被96孔酶標(biāo)板，以融合10 d后雜交瘤細(xì)胞的上清為一抗，以SP2/0-Ag14細(xì)胞上清為陰性對(duì)照，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗.測(cè)定雜交瘤細(xì)胞上清的450 nm吸光度(A450)值(P)和SP2/0-Ag14細(xì)胞上清的A450值(N)，P/N≥2.1為陽(yáng)性.將陽(yáng)性孔中細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化，直至出現(xiàn)陽(yáng)性單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)凍存.

4) 腹水的制備和抗體的純化：BALB/c小鼠腹腔注射500 μL無(wú)菌液體石蠟，10 d后，接種雜交瘤細(xì)胞1×106～2×106個(gè)/只，待小鼠腹部明顯膨脹，抽取腹水，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清.0.45 μm濾器(Millipore公司)過(guò)濾，將過(guò)濾后的腹水用Protein G進(jìn)行純化，純化后經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)4 ℃ 透析后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定.

1.2.3 mAb的特性鑒定

1) 亞型的鑒定：根據(jù)mAb亞型檢測(cè)試劑盒(Thermo Scientific 公司)說(shuō)明書(shū)對(duì)抗體進(jìn)行分型.

2) 用間接ELISA方法計(jì)算親和常數(shù).以0.5(Ag)和1.0(Ag′) μg/mL的抗原質(zhì)量濃度包被酶標(biāo)板，將抗體倍比稀釋?zhuān)钥贵w濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)作圖，曲線(xiàn)出現(xiàn)平臺(tái)期時(shí)表示抗原被全部結(jié)合，以此時(shí)的A450值為100%，找出50%對(duì)應(yīng)的A450值，代入公式，即可得親和常數(shù)[6]:

式中c(Ag)和c(Ag′)為不同的包被抗原濃度，c(Ab)和c(Ab′)為對(duì)應(yīng)的mAb濃度.

3) 效價(jià)檢測(cè)：對(duì)純化后的抗體用間接ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，設(shè)置陰性對(duì)照，P/N≥2.1的最高抗體稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià).

4) 蛋白免疫印記(Western blot)鑒定mAb特異性：將實(shí)驗(yàn)室自制的His標(biāo)簽蛋白和HpFlaA蛋白在95 ℃變性5 min后進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE檢測(cè).220 mA恒流，55 min轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的牛奶(PBS+0.1%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20，即PBST配制)封閉1 h；用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的BSA稀釋mAb和His標(biāo)簽抗體，室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次7 min；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗用PBST按1∶5 000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h，PBST洗3次，每次7 min，使用化學(xué)發(fā)光液顯色.

5) 樣本的來(lái)源和處理：臨床樣本為患者的糞便，由北京新興四寰生物技術(shù)有限公司篩選提供.其中5份陽(yáng)性樣本(3份弱陽(yáng)性“+”、1份較強(qiáng)陽(yáng)性“++”、1份強(qiáng)陽(yáng)性“+++”和3份陰性“—”樣本).用天平稱(chēng)取相同量樣本，用PBS溶解，作為抗原.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的制備

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)目的片段的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到1 300 bp左右的基因片段(圖1(a))，與預(yù)期相符.將重組質(zhì)粒PET-28a-HpflaA經(jīng)SacⅠ和XholⅠ限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后(圖1(b))得到1 300 bp左右的片段，與PCR結(jié)果相符，為目的基因片段，且測(cè)序結(jié)果正確，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 重組質(zhì)粒PET-28a-HpflaA的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid PET-28a-HpflaA

2.1.2 重組蛋白的表達(dá)純化

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，涂板，挑取單菌落進(jìn)行IPTG小量誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示在約54 ku處有一條清晰條帶(未誘導(dǎo)則無(wú)此條帶).隨后將陽(yáng)性菌落大量擴(kuò)增，經(jīng)超聲破碎、離心獲得裂解液、上清和沉淀，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(圖2(a))，結(jié)果顯示蛋白在沉淀中大量表達(dá).從包涵體中對(duì)HpFlaA進(jìn)行純化，以1 μg/μL BSA為對(duì)照，純化的HpFlaA抗原質(zhì)量濃度達(dá)到3 μg/μL(圖2(b))，且純化后雜蛋白減少，純度較高，可用于免疫小鼠.

(a)重組蛋白可溶性鑒定，M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(下同)，1.上清,2.沉淀,3.全菌體；(b)純化后重組蛋白的濃度測(cè)定.圖2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定Fig.2 Expression and identification of recombinant protein

2.2 mAb的制備和鑒定

2.2.1 單克隆雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建與篩選

小鼠免疫3次后，眼眥取血，以未免疫小鼠的血清為陰性對(duì)照，間接ELISA法測(cè)定小鼠血清效價(jià).選用效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行脾臟加強(qiáng)免疫，并進(jìn)行細(xì)胞融合.細(xì)胞融合后10 d左右，取細(xì)胞上清，通過(guò)間接ELISA法進(jìn)行融合檢測(cè),共得到196個(gè)陽(yáng)性孔.由于此時(shí)所得陽(yáng)性孔中的細(xì)胞并不是由同一雜交瘤細(xì)胞增殖而來(lái)，所以為了得到單克隆細(xì)胞需要對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行有限稀釋克隆化，共6輪，得到5株單克隆雜交瘤細(xì)胞(2G2、2G10、3E2、3E4和4H3).取這5株雜交瘤細(xì)胞的上清進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，以SP2/0-Ag14細(xì)胞上清為陰性對(duì)照(NC).圖3表明這5株雜交瘤細(xì)胞都能穩(wěn)定分泌HpFlaA抗體.

圖3 間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞株Fig.3 Screening of hybridoma cell lines by indirect ELISA

2.2.2 抗體的分型

抗體的分型結(jié)果決定單抗后續(xù)的純化和應(yīng)用方法.收集雜交瘤細(xì)胞上清，根據(jù)mAb亞型ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)抗體進(jìn)行分型；并以HRP標(biāo)記的鼠抗(GAM-HRP)為陽(yáng)性對(duì)照，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的A450值，結(jié)果如表1所示，可見(jiàn)5株雜交瘤細(xì)胞的mAb均為IgG1型.

表1 mAb的亞型鑒定Tab.1 Subtype identification of mAb

2.2.3 腹水的制備與純化

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備抗體，并用Protein G層析介質(zhì)進(jìn)行純化.純化后的抗體經(jīng)SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，結(jié)果顯示獲得5株高純度的mAb(圖4).純化后抗體的質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果如下：2G2為4.9 mg/mL，2G10為5.1 mg/mL，3E2為0.95 mg/mL，3E4為5.1 mg/mL，4H3為3.5 mg/mL.從SDS-PAGE結(jié)果(圖4)可以看出mAb的重鏈約為54 ku，輕鏈約為26 ku.每個(gè)抗體有兩條重鏈和兩條輕鏈，因此mAb的分子質(zhì)量約為160 ku.

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)純化后mAb的純度Fig.4 The purity of purified mAb identified by SDS-PAGE

2.2.4 抗體的親和常數(shù)測(cè)定

通過(guò)間接ELISA法得到mAb的親和曲線(xiàn)(以2G2為例，如圖5所示)，在曲線(xiàn)上找出50%的A450值，代入公式得到2G2、2G10、3E2、3E4和4H3的親和常數(shù)Ka分別為2.7×107，1.7×108，8.0×107，1.1×108和1.1×108L/mol.5株雜交瘤細(xì)胞的mAb的親和常數(shù)均大于107，表明上述mAb的親和力較高.

圖5 間接ELISA測(cè)定2G2 mAb的親和曲線(xiàn)Fig.5 Affinity curves of the 2G2 mAb detected by indirect ELISA

2.2.5 抗體的效價(jià)檢測(cè)

對(duì)純化后的抗體用間接ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，設(shè)置陰性對(duì)照(NC)，結(jié)果如圖6所示:2G2、2G10、3E2、3E4和4H3的效價(jià)分別為1∶128 000，1∶1 024 000，1∶512 000，1∶512 000和1∶1 024 000，其中2G10和4H3的效價(jià)最高.

圖6 純化后mAb的效價(jià)Fig.6 Titers of purified mAb

2.2.6 抗體的特異性檢測(cè)

采用間接ELISA和Western blot同時(shí)驗(yàn)證抗體的特異性.將實(shí)驗(yàn)室自制的His標(biāo)簽蛋白(His-protein，作為對(duì)照)和HpFlaA同時(shí)包被酶標(biāo)板(0.5 μg/mL)，以5株雜交瘤細(xì)胞的mAb為一抗，結(jié)果如圖7(a)所示，mAb只能和HpFlaA反應(yīng).同時(shí)以His標(biāo)簽抗體和5株雜交瘤細(xì)胞的mAb為一抗，進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，如圖7(b)所示,5株雜交瘤細(xì)胞的mAb均不與自制的His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)，僅特異性地識(shí)別目標(biāo)蛋白，與間接ELISA結(jié)果相同.

圖7 mAb的特異性檢測(cè)Fig.7 Specificity detection of mAb

2.2.7 雙抗夾心ELISA的初步建立

采用棋盤(pán)法將5株mAb分別作為包被抗體，其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記生物素(Bio-)的抗體作為檢測(cè)抗體，進(jìn)行配對(duì)篩選.結(jié)果如表2所示，可知2G2-2G10、2G2-3E4、2G2-4H3、2G10-2G10、3E4-3E4和3E4-4H3為陽(yáng)性配對(duì).其中2G2-3E4的反應(yīng)值稍高于其他配對(duì)，但仍不理想，因此后續(xù)需要對(duì)此體系進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較好的準(zhǔn)確度和靈敏度.

表2 雙抗體夾心ELISA配對(duì)篩選Tab.2 Pairwise screening bydouble antibody sandwich ELISA

2.2.8 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)臨床樣本

采用上述雙抗體夾心ELISA法中配對(duì)效果最好的一組2G2-3E4(以2G2為包被抗體，以3E4為檢測(cè)抗體)檢測(cè)臨床樣本，結(jié)果如表3所示.雖然3份弱陽(yáng)性樣本中出現(xiàn)了一份漏檢，但是3份陰性樣本(6～8)的檢測(cè)結(jié)果均正確，未出現(xiàn)假陽(yáng)性；較強(qiáng)和強(qiáng)陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果均正確.由此初步斷定所建立的雙抗體夾心ELISA體系可以用于檢測(cè)臨床樣本.

表3 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)臨床樣本Tab.3 Clinical sample detection bydouble antibody sandwich ELISA

3 討 論

目前，對(duì)于幽門(mén)螺桿菌感染的診斷方法依據(jù)是否依賴(lài)胃鏡檢查分為兩類(lèi)：一類(lèi)是依賴(lài)于胃鏡活檢的侵襲性檢查法，包括快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、胃黏膜直接涂片染色鏡檢、基因檢測(cè)方法等，缺點(diǎn)是胃鏡檢查操作繁瑣，對(duì)患者造成疼痛，不適合兒童和妊娠期婦女；另一類(lèi)是不依賴(lài)于胃鏡活檢的非侵襲性檢查法，包括13/14C呼氣試驗(yàn)，15N-氮排除實(shí)驗(yàn)，免疫學(xué)血清抗體測(cè)定等，13/14C呼氣試驗(yàn)在臨床上應(yīng)用普遍，優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確率較高，但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴或伴有放射性污染.免疫學(xué)血清抗體測(cè)定檢測(cè)特異性較高，但患者并不是在感染幽門(mén)螺桿菌后體內(nèi)立刻出現(xiàn)特異性抗體，而且在幽門(mén)螺桿菌根除后抗體仍然可以存在幾個(gè)月甚至一年，還存在交叉反應(yīng)性抗體[7-8].侵襲性和非侵襲性檢查法對(duì)于感染幽門(mén)螺桿菌的診斷都不讓人十分滿(mǎn)意，而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)糞抗原技術(shù)是一種價(jià)格低廉、安全、準(zhǔn)確、患者依從性好的診斷方法[8].幽門(mén)螺桿菌定植在人胃黏膜上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞脫落時(shí)會(huì)攜帶含幽門(mén)螺桿菌抗原的幽門(mén)螺桿菌代謝產(chǎn)物，與死亡菌體一起通過(guò)糞便排出體外[9]，因此可通過(guò)檢測(cè)糞幽門(mén)螺桿菌抗原推斷患者是否感染幽門(mén)螺桿菌.幽門(mén)螺桿菌的毒力因子主要有尿素酶、鞭毛、黏附素、熱休克蛋白、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白 A 和空泡毒素等[10-11].目前已有研究成功制備出幽門(mén)螺桿菌全菌體、UreB、HpaA和空泡毒素等重要毒力因子的mAb，而本研究成功制備出FlaA的mAb，因此可以通過(guò)將幽門(mén)螺桿菌不同毒力因子的mAb以及全菌蛋白的mAb同時(shí)檢測(cè)臨床糞便樣本，進(jìn)而比較出檢測(cè)效果、準(zhǔn)確度、靈敏度俱佳的mAb，以建立更準(zhǔn)確、迅速、靈敏的糞抗原檢測(cè)方法.然而由于糞便成分比較復(fù)雜[12-13]，且不同患者糞便中幽門(mén)螺桿菌抗原成分的量也有差異，而幽門(mén)螺桿菌的不同抗原成分的mAb在檢測(cè)時(shí)可以互為補(bǔ)充，以最大限度地降低臨床上對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染者的漏檢率，大大提高診斷幽門(mén)螺桿菌感染的準(zhǔn)確率，預(yù)防由于幽門(mén)螺桿菌感染所誘發(fā)的疾病,有較好的應(yīng)用前景.

本研究成功構(gòu)建了PET-28a-HpflaA重組表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出HpFlaA融合蛋白.以純化的融合蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，通過(guò)傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)成功制備出5株能穩(wěn)定分泌抗HpFlaA的mAb的雜交瘤細(xì)胞株.對(duì)純化后的mAb進(jìn)行性質(zhì)鑒定，結(jié)果表明抗體具有純度好、親和力高、特異性好、效價(jià)高的特點(diǎn).本研究還將5株mAb通過(guò)棋盤(pán)法進(jìn)行配對(duì)，以建立較好的雙抗夾心ELISA檢測(cè)體系，結(jié)果表明以2G2為包被抗體，以3E4為檢測(cè)抗體的檢測(cè)體系反應(yīng)值較高，并用此體系檢測(cè)8份臨床樣本發(fā)現(xiàn)陰性、較強(qiáng)陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果均正確，但3份弱陽(yáng)性樣本中卻出現(xiàn)了一份漏檢和一份不確定結(jié)果，推測(cè)可能是因?yàn)樗⒌碾p抗夾心檢測(cè)方法準(zhǔn)確度較好，但靈敏度還存在缺陷，在檢測(cè)弱陽(yáng)性樣本時(shí)由于其中所含HpFlaA抗原較少，未達(dá)到檢測(cè)體系的檢測(cè)下限，所以出現(xiàn)漏檢.

后續(xù)需要進(jìn)一步優(yōu)化2G2-3E4雙抗夾心ELISA體系，以達(dá)到更高的靈敏度，降低檢測(cè)下限，從而降低漏檢率，再用優(yōu)化后的體系檢測(cè)大量的臨床樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和靈敏度,為HpFlaA檢測(cè)試劑盒的制備奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

致謝：感謝北京新興四寰生物技術(shù)有限公司在臨床樣本檢測(cè)過(guò)程中提供的幫助.