痛風(fēng)清熱方對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18的影響

郭玉星 朱珊瑩 康佩芝 劉文龍 易法銀 邵先舫 熊輝 劉永利 毛果

〔摘要〕 目的 觀察不同劑量痛風(fēng)清熱方對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18炎性因子表達(dá)的影響。方法 選取SD雄性大鼠72只，隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組及痛風(fēng)清熱方高、中、低劑量組，每組12只。模型組、痛風(fēng)清熱方各劑量組及秋水仙堿組按經(jīng)典Coderre大鼠動(dòng)物模型造模，正常對(duì)照組在相應(yīng)部位注射等量生理鹽水。痛風(fēng)清熱方高、中、低劑量組分別予以60、30、15 g/kg痛風(fēng)清熱方混懸液灌胃干預(yù)，秋水仙堿組予以0.09 g/kg秋水仙堿懸濁液灌胃。于造模前、造模后4、8、12、24、48 h測(cè)量踝關(guān)節(jié)周徑，測(cè)定受試踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù);于造模后48 h取受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織;采用HE染色觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化;采用ELISA法檢測(cè)組織中TNF-α、IL-1β、IL-18的含量。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組呈現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)炎病理變化，在光鏡下可見不同程度的滑膜上皮脫落、血管增生以及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而痛風(fēng)清熱方各劑量組和秋水仙堿組則病理變化較少。與正常對(duì)照組比較，模型組、痛風(fēng)清熱方各劑量組、秋水仙堿組造模后4、8、12、24、48 h關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，痛風(fēng)清熱方各劑量組及秋水仙堿組造模后4、8、12、24、48 h關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)各有不同程度降低（P<0.05），其中秋水仙堿組腫脹指數(shù)降低最明顯，其次為痛風(fēng)清熱方高劑量組（P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型組、痛風(fēng)清熱方各劑量組及秋水仙堿組大鼠滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18水平均增高（P<0.05）;與模型組比較，痛風(fēng)清熱方各劑量組及秋水仙堿組大鼠滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18水平均降低（P<0.05），其中秋水仙堿組TNF-α、IL-1β、IL-18水平降低最顯著，其次為痛風(fēng)清熱方高劑量組（P<0.05）。結(jié)論 痛風(fēng)清熱方對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有明顯消腫作用。其作用可通過(guò)降低滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18炎性因子的表達(dá)，從而改善局部組織炎癥作用，而且隨著痛風(fēng)清熱方劑量的增加，其作用越強(qiáng)。

〔關(guān)鍵詞〕 痛風(fēng)清熱方;痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù);TNF-α;IL-1β;IL-18

〔中圖分類號(hào)〕R255.6? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.004

The Effect of Tongfeng Qingre Recipe on TNF-α， IL-1β and IL-18 in Synovium

Tissue of Rats with Acute Gouty Arthritis

GUO Yuxing1，2， ZHU Shanying1， KANG Peizhi2， LIU Wenlong1， YI Fayin1*， SHAO Xianfang3*，

XIONG Hui1， LIU Yongli3， MAO Guo2

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Affiliated Hospital of Hunan Institute of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 3. Changde First Hospital of Traditional Chinese Medicine， Changde， Hunan 415100， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of different doses of Tongfeng Qingre Recipe on the expression of inflammatory factor TNF-α， IL-1β and IL-18 in the synovium of ankle joint of rats suffering acute gouty arthritis. Methods 72 male SD rats were randomly divided into 6 groups， including normal control group， model group， colchicine group and Tongfeng Qingre Recipe high-dose， medium-dose and low-dose groups， with 12 rats in each group. The model group and the high， medium and low dose groups and the colchicine group were established the classic Coderre models of the rats， however， rats from the normal control group was given normal saline in the corresponding parts for same dose of the formula utilized in other groups. The high， medium and low dose Tongfeng Qingre Recipe group received intragastric administration of Tongfeng Qingre Recipe traditional Chinese medicine turbid liquid of different dose of 60， 30， 15 g/kg. The colchicine group received intragastric administrated of 0.09 g/kg colchicine turbid liquid. The ankle circumference and the swelling index of the ankle was measured before and 4， 8， 12， 24 and 48 hours after the establishment of the model. Synovial tissue of the ankles was collected 48 hours after modeling. HE staining was used to observe ankle joint synovial tissue pathological changes， and the content of TNF-α， IL-1β and IL-18 in the synovium of ankle joint were determined by ELISA. Results Compared with the normal control group， the model group showed obvious pathological changes of arthritis. Under the light microscope， the model group showed different degrees of synovium epithelial detachment， vascular proliferation and a large number of inflammatory cell infiltration， while the Tongfeng Qingre Recipe group of different dose and colchicine group showed less pathological changes. Compared with the normal control group， the swelling index of the model group， Tongfeng Qingre Recipe group of different dose and colchicine group increased significantly at 4， 8， 12， 24 and 48 hours after modeling （P<0.05）. Compared with the model group， the joint swelling index in the Tongfeng Qingre Recipe group of different dose and colchicine group decreased at 4， 8， 12， 24 and 48 hours after modeling （P<0.05）， and the swelling index of the colchicine group decreased most obviously， followed by the Tongfeng Qingre Recipe high-dose group （P<0.05）. Compared with the normal control group， the levels of? TNF-α， IL-1β and IL-18 in the synovium of the model group， Tongfeng Qingre Recipe group of different dose and colchicine group were significantly higher （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-18 in synovium of rats in the Tongfeng Qingre Recipe group of different dose and colchicine group were lower （P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-1β and IL-18 in colchicine group decreased most significantly， followed by the Tongfeng Qingre Recipe high-dose group （P<0.05）. Conclusion Tongfeng Qingre Recipe has obvious detumescence effect on gouty arthritis in rats. Its effect can be achieved by reducing the expression of TNF-α， IL-1β and IL-18 and other inflammatory factors in local tissues， and the effect is stronger with the increase of the dose of Tongfeng Qingre Recipe.

〔Keywords〕 Tongfeng Qingre Recipe; gouty arthritis; swelling index of the ankle; TNF-α; IL-1β; IL-18

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是痛風(fēng)急性發(fā)作的首發(fā)癥狀，其典型的臨床表現(xiàn)為急性發(fā)作的、劇烈的關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛。而隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡逐漸年輕化[1]。中國(guó)痛風(fēng)診療指南提出，高劑量秋水仙堿能有效緩解痛風(fēng)急性期患者的臨床癥狀，但其胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率較高，從而易導(dǎo)致部分患者因不良反應(yīng)而停藥[2]。因此，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥角度出發(fā)，發(fā)掘療效確切、不良反應(yīng)少的方藥組成具有重要意義。中醫(yī)藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎由來(lái)已久且療效確切[3-4]，但其作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的闡釋。通過(guò)前期臨床療效觀察發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)清熱方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎可以顯著改善臨床癥狀，具有確切療效、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)[4-6]。本文主要研究了痛風(fēng)清熱方對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18炎性因子的影響，并從不同劑量進(jìn)行分析。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探討痛風(fēng)清熱方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，以及劑量高低對(duì)痛風(fēng)清熱方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

健康2月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠72只（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018），體質(zhì)量200～220 g。購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度21～25 ℃，空氣濕度50%～60%。所有實(shí)驗(yàn)均按湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)和國(guó)際動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行[7]。

1.2? 藥物

痛風(fēng)清熱方組成：土茯苓20 g，紫花地丁15 g，穿山甲10 g，生大黃10 g，黃柏10 g，秦艽10 g，白芥子10 g，山慈菇10 g，芒硝10 g，炒蒼術(shù)10 g，秦皮15 g，茵陳10 g，蒲公英10 g，菝葜10 g，甘草6 g。中藥飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院藥劑科進(jìn)行煎煮、濃縮至原藥濃度3 g/mL，使用時(shí)溶于蒸餾水，根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度懸混液。秋水仙堿片0.5 mg/片（批號(hào)：H53021389，昆明制藥集團(tuán)股份有限公司），將其研成細(xì)粉末溶于蒸餾水，配置成含藥濃度為1.1 mg/mL懸濁液。

1.3? 主要試劑與儀器

IL-1β（批號(hào)：ELK1272）、IL-18（批號(hào)：ELK2270）、TNF-α（批號(hào)：ELK1396）ELISA試劑盒均購(gòu)自科鹿（武漢）生物科技有限責(zé)任公司;無(wú)水乙醇（批號(hào)：1009218）、二甲苯（批號(hào)：10023418）、氨水（批號(hào)：10002018）、中性樹膠（批號(hào)：10004160）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蘇木素染液（批號(hào)：AS1055A）、伊紅染液（批號(hào)：AS1094）均購(gòu)自艾仕幫藥物保健控股有限公司。

酶標(biāo)儀（型號(hào)：DR-200Bs，無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）;臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16c，上海安亭科學(xué)儀器廠）;冷凍離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器）;制冰機(jī)（型號(hào)：IMS-20，常熟市雪科電器有限公司）;恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：GNP9160，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;脫水機(jī)（型號(hào)：JT-12K）、包埋機(jī)（型號(hào)：JB-P5）、凍臺(tái)（型號(hào)：JB-L5）、組織攤片機(jī)（型號(hào)：JK-5）均購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司;病理切片機(jī)（型號(hào)：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）;烤箱（型號(hào)：DHG-9123A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;載玻片及蓋玻片（型號(hào)：10212432C，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組及模型建立

將72只SD雄性大鼠飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即正常對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組及痛風(fēng)清熱方高、中、低劑量組，每組12只。模型組、痛風(fēng)清熱方各劑量組和秋水仙堿組按經(jīng)典Coderre大鼠動(dòng)物模型造模[8]，第5天灌胃之前，在左側(cè)踝關(guān)節(jié)腔中注入濃度為25 mg/mL的尿酸鈉溶液0.2 mL，正常對(duì)照組的大鼠則于相應(yīng)部位注入等量的生理鹽水。

2.2? 給藥

根據(jù)低、中、高劑量組用藥量比1∶2∶4的比例，痛風(fēng)清熱方低劑量組以每日15 g/kg（約相當(dāng)于成人臨床日用量按體表面積折算的等效劑量），中劑量組以每日30 g/kg，高劑量組以每日60 g/kg的灌胃劑量進(jìn)行中藥混懸液灌胃;秋水仙堿組以每日0.09 g/kg的劑量予以秋水仙堿懸濁液灌胃;而正常對(duì)照組、模型組分別給予等容積的蒸餾水灌胃。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。從灌胃的第5天開始行踝關(guān)節(jié)造模，造模后繼續(xù)灌胃2 d。

2.3? 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1? 踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)測(cè)量? 分別于造模前和造模后4、8、12、24、48 h采用不銹鋼帶表卡尺、2～3 mm寬紙條測(cè)量各組大鼠左后足踝關(guān)節(jié)下0.5 mm處的周徑。對(duì)踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)進(jìn)行測(cè)定[9]，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)=（造模后周長(zhǎng)-造模前周長(zhǎng)）/造模前周長(zhǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均由同一個(gè)人操作（盡量保證測(cè)量的準(zhǔn)確性），每組重復(fù)3次，取平均值。

2.3.2? HE染色觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化? 干預(yù)結(jié)束后，將提取的踝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行脫水、浸蠟，并且包埋、切片后，再用HE染色對(duì)切片進(jìn)行染色，最后鏡下觀察病理學(xué)變化并顯微采圖。

2.3.3? ELISA檢測(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18含量? 干預(yù)結(jié)束后，將滑膜組織標(biāo)本置于適量液氮下研磨粉碎，再加入適量的生理鹽水，勻漿后3 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm，取其上清液待測(cè);采用ELISA法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。測(cè)出吸光度值后，以測(cè)得的吸光度值（OD）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的回歸線性曲線并得出相應(yīng)的曲線方程。將所測(cè)得的各樣本的OD代入到方程中，計(jì)算出各樣本的含量作為所測(cè)指標(biāo)含量。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以“x±s”表示。組間比較采用One-Way ANOVA單因素方差分析，方差齊時(shí)選擇LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3檢驗(yàn);不滿足正態(tài)性時(shí)選擇順序和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)比較

與正常對(duì)照組相比，模型組、痛風(fēng)清熱方各劑量組及秋水仙堿組各時(shí)刻腫脹指數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示各造模大鼠踝關(guān)節(jié)明顯腫脹，造模成功;與模型組相比，痛風(fēng)清熱方各劑量組與秋水仙堿組4、8、12、24、48 h腫脹指數(shù)均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與秋水仙堿組比較，痛風(fēng)清熱方各劑量組腫脹指數(shù)稍高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與痛風(fēng)清熱方低劑量組相比，痛風(fēng)清熱方中、高劑量組腫脹指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與痛風(fēng)清熱方中劑量組相比，痛風(fēng)清熱方高劑量組腫脹指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.2? 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變情況

正常對(duì)照組見滑膜上皮排列完整，滑膜下血管分布正常，無(wú)血管增生，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組見滑膜上皮脫落，甚至消失不見，有血管增生，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)炎病理變化，提示造模成功;與模型組對(duì)比，秋水仙堿組與痛風(fēng)清熱方各劑量組滑膜上皮相對(duì)完整，滑膜細(xì)胞增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，血管增生減少。見圖1。

3.3? 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組、痛風(fēng)清熱方各劑量組及秋水仙堿組TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，痛風(fēng)清熱方各劑量組、秋水仙堿組TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與秋水仙堿組比較，痛風(fēng)清熱各劑量組TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平稍高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與痛風(fēng)清熱方低劑量組相比，痛風(fēng)清熱方中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與痛風(fēng)清熱方中劑量組相比，痛風(fēng)清熱方高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

4 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)及組織而導(dǎo)致?lián)p傷和炎性反應(yīng)的過(guò)程，其急性發(fā)作而引起的劇烈疼痛嚴(yán)重影響了人們的正常生活，隨著病情嚴(yán)重程度的增加，還可能導(dǎo)致殘疾，更進(jìn)一步地加重則可引起心血管、腎臟疾病，最終影響生命健康。關(guān)于痛風(fēng)急性發(fā)作期，及早有針對(duì)性地使用秋水仙堿、非甾體類抗炎藥及糖皮質(zhì)激素可有效達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的效果，從而提高患者生活質(zhì)量。但上述藥物均易引起胃腸道等不良反應(yīng)，只能通過(guò)劑量的減少甚至停藥來(lái)避免[10-12]。因此，積極發(fā)展中醫(yī)學(xué)療效佳、不良反應(yīng)少、安全性高的特色，協(xié)助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的診治顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)選取的痛風(fēng)清熱方（曾用名：痛風(fēng)一號(hào)方、痛風(fēng)康方）是在四妙散、五味消毒飲的基礎(chǔ)上加減化裁而成，作為是湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院的協(xié)定方，已在臨床使用十余年，對(duì)于預(yù)防與治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有明顯的臨床療效[13-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痛風(fēng)清熱方可明顯改善大鼠局部組織腫脹，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并降低滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-18炎性因子表達(dá)水平（P<0.05），從而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的效果，這與前期文獻(xiàn)研究結(jié)果是相符的[4-6，13-15]。研究[16-18]表明，TNF-α、IL-1β、IL-18等多種炎性因子在痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)重中發(fā)揮著重要作用，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中沉積的尿酸鹽結(jié)晶可刺激機(jī)體TNF-α、IL-1β、IL-18等多種炎性因子的釋放，炎性因子則進(jìn)一步引起炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作[19-21]。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可看出，隨著痛風(fēng)清熱方劑量的升高，其抗炎鎮(zhèn)痛的效果也逐漸增加，但對(duì)量效關(guān)系的探討還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。有研究[22]表明，四妙散加減治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎較秋水仙堿有一定優(yōu)勢(shì)，且不良反應(yīng)發(fā)生率較低，因此，后期可以研究痛風(fēng)清熱方劑量的進(jìn)一步增加是否引起療效的增加，甚至較秋水仙堿更具優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎拓展了治療方案，更深層次地探討了痛風(fēng)清熱方的方藥機(jī)理與效應(yīng)途徑，為提高中醫(yī)臨床療效、減少藥物不良反應(yīng)提供了有效幫助，但炎性因子爆發(fā)炎癥反應(yīng)的上游路線頗多，痛風(fēng)清熱方如何干預(yù)具體靶點(diǎn)將是本實(shí)驗(yàn)下一步的主要研究方向。

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