祛風宣肺湯治療冷刺激聯(lián)合屋塵螨誘導哮喘小鼠的作用機制*

林利，郭婕，朱佳

1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京210000；2.南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院，江蘇 南京210000

支氣管哮喘是常見的慢性呼吸道疾病，臨床上以可逆性氣流受限和氣道高反應性為主要表現(xiàn)。全球范圍內(nèi)哮喘患者總數(shù)超過3億［1］。近年來，哮喘患病率顯著上升［2］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，氣溫降低是誘發(fā)哮喘發(fā)作的常見環(huán)境因素［3］。哮喘患者的門診就診人數(shù)及住院率的增長常伴隨著冷風過境、氣溫驟降等氣候變化［4－5］。目前，哮喘的臨床治療主要以糖皮質(zhì)激素和β受體激動劑等為主，可有效改善哮喘患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，但仍存在部分患者藥物不耐受、藥物不敏感、停藥后易復發(fā)、藥物不良反應大、患者依從性差等問題［6］，哮喘控制的現(xiàn)狀不盡如人意。

中醫(yī)學認為，風寒之邪引動伏痰而發(fā)哮喘屬于“冷哮證”的范疇，擬以祛風化痰、扶正溫陽論治。研究表明，中西醫(yī)結(jié)合療法治療哮喘，在穩(wěn)定病情、減少發(fā)作次數(shù)、減輕藥物不良反應等方面具有優(yōu)勢［7－8］。祛風宣肺湯是由江蘇省名中醫(yī)朱佳教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合中醫(yī)藥治療哮喘的深刻認識總結(jié)的而成，治療咳嗽變異性哮喘、變應性咳嗽方面頗有療效。實驗證實，祛風宣肺湯具有降低氣道高反應性，減輕肺部炎性細胞浸潤，抑制肺組織神經(jīng)源性炎癥的作用［9－11］。本研究主要考察了祛風宣肺湯對冷刺激聯(lián)合屋塵螨（house dust mite，HDM）誘導過敏性哮喘小鼠的干預機制。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性BALB／c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017－0005，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（蘇）2014－0001，溫度22～26℃，濕度50%～60%，自由進食飲水。實驗設計和操作經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學倫理委員會審批，倫理批號：ACU190902。

1.2 藥物與試劑祛風宣肺湯（紫蘇梗、炙麻黃、蟬蛻、半夏、佛耳草、白前、紫菀、百部、全蝎、南沙參、甘草，南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院中藥房）。HDM（美國Greer Laboratory公司，貨號：XPB70D3A25）；免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白細胞介素－5（interleukin－5，IL－5）、IL－13 ELISA試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號分別為：88－7237－88、88－7054－88、88－7137－88）；兔抗鼠受體電位M8亞型通道蛋白（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）多克隆抗體（美國Novus生物公司，貨號：NBPI－97311）。

1.3 儀器XSP－18B型光學顯微鏡（江南光電集團股份有限公司）；Syne－Rgy2型Biostack Ready酶標儀（美國Bio－Tek公司）；EG1150H型包埋儀（德國Leica公司）；Sorvall Legend Micro 17R型冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備將祛風宣肺湯的中藥飲片加水浸泡后，煎煮2次，每次1 h，混合并過濾兩次藥液，濃煎后加純水定容至1.183 kg·L－1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠分組和模型建立將小鼠隨機分為5組，即空白組、冷刺激組、HDM組、模型（冷刺激＋HDM）組、祛風宣肺湯（11.83 g·kg－1）組，每組8只；造模方法在傳統(tǒng)方法［12］的基礎上進行改進，HDM組、模型組和祛風宣肺湯組分別于第0天、第7天、第14天腹腔注射HDM（0.5 g·L－1）100μL，并于第21至第23天連續(xù)3 d滴鼻HDM（2.5 g·L－1）50μL。

將小鼠放入自制的低溫箱內(nèi)，即PP材料鼠籠（32 cm×21 cm×17 cm），撤除墊料，將籠深埋在碎冰中1 h，籠內(nèi)溫度低于10℃，籠內(nèi)溫度控制在（10±3）℃。第21至第23天，模型組和祛風宣肺湯組在滴鼻操作后與冷刺激組置于低溫箱30 min。祛風宣肺湯組第0～24天每天給藥1次，給藥時間均在HDM處理前約30 min。每5天稱小鼠的體質(zhì)量，并調(diào)整劑量。

2.3 檢測外周嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）計數(shù)和血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）水平 最后一次滴鼻24 h后，麻醉小鼠，摘除眼球，收集血液，將20μL全血和380μL嗜酸性粒細胞計數(shù)液混勻滴于細胞計數(shù)板上，光鏡下觀察外周血EOS計數(shù)；剩余全血室溫靜置2 h，3 500 r·min－1離心15 min，取血清，用ELISA試劑盒檢測血清IgE水平。

2.4 檢測肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的細胞因子小鼠脫頸處死，逐層分離頸胸部組織，暴露肺葉及頸部氣管，結(jié)扎左側(cè)肺葉，取1 mL的PBS灌洗右肺，收集BALF，4℃、1 000 r·min－1離心10 min，取上清液，－20℃保存。ELISA試劑盒檢測BALF中IL－5和IL－13水平。

2.5 肺組織病理和免疫組織化學每組隨機取3只小鼠，取左肺葉，保存于4%多聚甲醛中48 h，石蠟包埋、脫水、切片后進行HE染色和免疫組化分析。光鏡下觀察組織病理學改變，顯微鏡下觀察靶蛋白的表達強度。根據(jù)染色程度進行半定量分析。以無染色計0，輕染計1，中染計2，強染計3，超強染計4［11］。分析操作由2名不參與本實驗的專業(yè)病理人員完成。

2.6 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準誤（±SEM），采用方差分析比較各組間的差異，Bonferroni檢驗進行秩后比較分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 觀察小鼠的一般情況空白組、冷刺激組小鼠未出現(xiàn)明顯異常的行為改變；HDM組、模型組小鼠激發(fā)前后出現(xiàn)甩頭、抓耳、撓鼻、煩躁多動等行為變化；祛風宣肺湯組小鼠偶見有抓耳、甩頭、撓鼻的動作。

3.2 檢測BALF中IL－5、IL－13水平與空白組相比，冷刺激組和HDM組小鼠的BALF中IL－5、IL－13水平升高，模型組IL－5、IL－13的水平極顯著升高（P＜0.000 1），以模型組復制效果最佳。與模型組比較，祛風宣肺湯組IL－5水平明顯降低（P＜0.05），IL－13水平有降低趨勢（P＞0.05）。見圖1。

圖1 支氣管肺泡灌洗液IL－5、IL－13細胞因子水平

3.3 檢測外周血EOS計數(shù)及IgE水平與空白組相比，冷刺激和HDM組小鼠的外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平升高，模型組小鼠外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平顯著升高（P＜0.01），以模型組復制效果最佳。與模型組比較，祛風宣肺湯組小鼠外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平均顯著降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 血中嗜酸性粒細胞計數(shù)及IgE水平

3.4 觀察肺組織病理形態(tài)學變化空白組、冷刺激組肺組織可見肺泡紋理清晰，肺泡間質(zhì)少量炎性細胞浸潤，氣道上皮完整，纖毛結(jié)構(gòu)清晰，肺組織形態(tài)基本正常；HDM組可見明顯肺泡間質(zhì)增寬，部分肺泡融合，氣道黏膜增厚，纖毛脫落，氣道周圍及肺泡間質(zhì)可見大量炎性細胞浸潤；模型組肺泡間質(zhì)及氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤增厚，部分肺泡融合，氣道上皮脫落；祛風宣肺湯組的肺泡結(jié)構(gòu)完整，紋理清晰，間質(zhì)可見少量炎性細胞浸潤，黏膜不厚，或見部分纖毛有脫落，病變程度明顯減輕。見圖3。

3.5 肺組織TRPM8蛋白表達情況與空白組相比，冷刺激組和HDM組小鼠肺組織TRPM8表達有升高的趨勢（P＞0.05），模型組小鼠肺組織TRPM8表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，祛風宣肺湯組小鼠TRPM8通道蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖3 肺組織病理形態(tài)學變化（HE，×200）

圖4 小鼠肺組織TRPM8蛋白表達情況（×200）

圖5 免疫組化半定量分析結(jié)果

4 討論

支氣管哮喘是一種涉及多種細胞及細胞組分的慢性呼吸道炎癥性疾病。一般認為，特異性炎癥反應是哮喘的重要病理機制。約50%哮喘患者表現(xiàn)為Th2細胞因子分泌增多、外周血EOS增加、血液IgE水平增高的病理特征［13］。EOS細胞型哮喘［14－15］、Th2細胞因子增高型哮喘［2，16］均屬于此類。IL－5和IL－13是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要細胞因子。CD4＋T細胞分化失衡，Th1／Th2細胞因子比例失調(diào)可導致IL－5、IL－13水平升高［17］，誘發(fā)哮喘或加重哮喘的癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，除Th2細胞，2型固有淋巴細胞作為非T非B細胞亦是IL－5、IL－13的重要來源［18］，參與哮喘的特異性免疫的病理生理機制［17－18］。目前尚不可知兩者在哮喘發(fā)生發(fā)展中各自所占有的比重，比較公認的是，氣道上皮的上游事件［主要調(diào)節(jié)因子如胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、IL－25、IL－33等與相應受體結(jié)合］增加Th2型細胞因子的分泌，引起下游事件的級聯(lián)反應，如特異性IgE水平升高，EOS、肥大細胞等炎性細胞增殖、局部募集與激活，最終導致氣道重塑［2，17］。

TRPM8是瞬時受體電位離子通道蛋白（TRPs）的一員，是一種非選擇性鈣離子通道，可被低溫（8～22℃）刺激或薄荷醇激活。研究表明，TRPM8表達于氣道迷走神經(jīng)、氣道上皮細胞和肥大細胞胞膜表面［19－21］。冷刺激可通過激活TRPM8，刺激迷走神經(jīng)傳入纖維產(chǎn)生電沖動，引起由迷走神經(jīng)支配的氣道腺體黏液分泌增加、支氣管平滑肌收縮等一系列氣道反射活動，導致氣道阻力增加［20］。冷刺激還可通過氣道上皮細胞和肥大細胞上的TRPM8增加炎癥因子（如IL－1β、IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、IL－13、IL－25、IL－33、GM－CS、TNF－α）的分泌和組胺的釋放而加重哮喘［21－22］。其中IL－1β可促進B細胞活化，激活Th2和Th17細胞參與哮喘和其他過敏性疾病的病理過程［23］。IL－6能促進急性反應蛋白的合成和IgE的轉(zhuǎn)化，并協(xié)調(diào)IL－1的表達，刺激T細胞的增殖和分化［24］；部分難治性哮喘患者痰標本和BALF中可見IL－6和IL－8水平升高［25］。IL－25可促進2型免疫反應［26］；IL－25、IL－33能介導ILC2s分泌IL－4、IL－5、IL－13等Th2細胞因子，參與哮喘的病理機制。因此，TRPM8通路的開放可促進哮喘的發(fā)生發(fā)展，過表達TRPM8通道蛋白可增加炎癥因子的分泌［27］，誘導炎癥反應。相反，拮抗TRPM8通道蛋白可減少炎癥因子分泌，或可緩解哮喘的癥狀。

祛風宣肺湯以苦溫麻黃宣肺平喘，辛溫紫蘇葉祛風散邪，蟬蛻、全蝎止痙祛風，半夏、佛耳草化痰理肺，白前、紫菀、百部降氣止咳，再佐以南沙參清肺養(yǎng)陰，以炙麻黃、半夏及紫蘇梗之燥，甘草為使，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏祛風解痙、理肺止咳之功效，臨床上用于反復咳嗽、干咳少痰的咳嗽變異性哮喘頗有療效。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用冷刺激或HDM干預均可刺激機體分泌IL－5、IL－13，導致EOS增殖，抗體表達增多，肺泡表面及氣道上皮的TRPM8通道蛋白表達增加，聯(lián)合冷刺激和HDM建模可顯著放大此生物學效應，從病理機制上模擬了因氣溫變化而急性發(fā)作的哮喘模型，使用祛風宣肺湯后，小鼠的炎癥指標明顯降低，病理改變顯著減輕，這初步解釋了哮喘患者門診量、住院率在換季時增加的現(xiàn)象及祛風宣肺湯的作用機理。結(jié)合文獻研究和實驗結(jié)果推測，祛風宣肺湯可通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生、下調(diào)TRPM8通道蛋白表達而緩解過敏性哮喘。而本實驗缺少小鼠的肺功能等相應指標，缺少設立TRP通道拮抗劑作為對照組，其具體機制仍需進一步研究。