五氯硝基苯亞急性暴露對卵巢甾體激素合成的影響

李雯，駱海燕，淡清華，鄶艷榮，高小博，陸彩玲*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

卵巢作為雌性哺乳動(dòng)物的性腺，其主要功能是分泌甾體激素及排卵。孕酮和E2作為卵巢組織分泌的主要甾體激素，其合成及分泌在女性月經(jīng)周期、卵泡發(fā)育、生殖妊娠等過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Steroids acute regulatory synthesis protein，StAR)是甾體激素合成的限速酶之一，它能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)中游離的膽固醇轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜中，這是甾體激素合成的初始步驟[1]。在膽固醇側(cè)鏈裂解酶(Cytochrome P450scc enzyme，P450scc)的作用下，進(jìn)入線粒體后的膽固醇被轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，后者經(jīng)過3β-羥甾脫氫酶(HSD3b)、細(xì)胞色素P450c17a酶(CYP17a1)等一系列酶的催化可生成孕酮及雄烯二酮等激素，其中雄烯二酮可在芳香化酶(Aromatase)的作用下轉(zhuǎn)化為E2[2]。卵巢內(nèi)甾體激素的合成是一系列甾體激素合成酶綜合調(diào)控的過程，這一過程易受到環(huán)境因素如農(nóng)藥、增塑劑、香煙煙霧等的干擾，從而導(dǎo)致激素合成及分泌異常，造成卵巢早衰、生育力下降等不良后果[3-5]。

五氯硝基苯(Pentachloronitrobenzene，PCNB)，又稱氯喹(Quintozene)，是一種常見的有機(jī)氯農(nóng)藥，常用于農(nóng)作物、中草藥的種植過程及城市中花卉、草坪等的病害防治，使用范圍廣泛[6]。PCNB化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期長，使用后可在土壤、水體中長期殘留[7]。人體可通過飲食、飲水、皮膚接觸等多種方式接觸PCNB，人群暴露風(fēng)險(xiǎn)高[8]。PCNB可造成肝臟損傷，且具有潛在的致癌性[9]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，PCNB及其代謝產(chǎn)物可穿過胎盤屏障，小鼠妊娠期PCNB暴露可導(dǎo)致子代腎臟發(fā)育不全、腭裂，并增加胎兒死亡率[10]。Metcalfe等[11]在對日本青鳉魚的研究中發(fā)現(xiàn)，PCNB暴露可導(dǎo)致受精卵發(fā)育異常，造成眼部畸形、大腦發(fā)育遲緩等不良后果。作為一種常見的環(huán)境污染物，目前國內(nèi)外對PCNB的研究主要集中在殘留物檢測、降解等方面，對生殖系統(tǒng)尤其是卵巢功能影響方面的研究不多。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PCNB連續(xù)暴露7 d可降低大鼠血清孕酮水平、增加生長卵泡比例，表明PCNB可影響正常卵巢功能[12]。亞急性暴露指≤30 d的重復(fù)染毒，在毒理學(xué)中常用于研究相對有限時(shí)間內(nèi)反復(fù)暴露某一毒物對生殖系統(tǒng)等的影響[13]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上通過對3周齡雌性SD大鼠連續(xù)PCNB亞急性暴露28 d，初步探討PCNB亞急性暴露對雌性大鼠甾體激素合成的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡雌性SD大鼠，體重(40±5)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2)℃，濕度50%～70%，光照12 h明暗交替，提供充足的糧食和水、自由進(jìn)食。所有實(shí)驗(yàn)均通過國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號：2016-017)。

二、主要試劑及儀器：PCNB(Sigma，美國)，玉米油(阿拉丁，中國)，孕酮測定試劑盒、E2測定試劑盒(Roche，瑞士)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)，StAR兔多克隆抗體、Aromatase兔多克隆抗體(ABclonal，美國)，P450scc兔多克隆抗體(Cell Signaling，美國)，β-actin小鼠單克隆抗體(Sigma，美國)，辣根過氧化物酶-山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶-山羊抗小鼠IgG抗體(中杉金橋)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(Branson SLP，美國)，全自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀(Biotek，美國)。

三、研究方法

1.動(dòng)物分組及PCNB亞急性暴露：將3周齡雌性SD大鼠30只隨機(jī)分成3組：給予50 mg·kg-1·d-1PCNB灌胃給藥的為低劑量組，給予100 mg·kg-1·d-1PCNB灌胃給藥的為高劑量組，給予等體積玉米油灌胃的為對照組，每組10只，連續(xù)灌胃28 d。灌胃期間每日對大鼠進(jìn)行稱重并記錄，同時(shí)對大鼠毛發(fā)、粘膜和自主活動(dòng)等一般情況進(jìn)行觀測并記錄。

2.組織取材：末次染毒24 h后通過陰道涂片觀察大鼠發(fā)情周期，于發(fā)情間期對大鼠進(jìn)行麻醉，取靜脈血后將大鼠安樂死，分離雙側(cè)卵巢組織，置生理鹽水中漂洗，剔除周圍脂肪組織、稱重并計(jì)算卵巢系數(shù)，卵巢系數(shù)=卵巢濕重/體重×100%。之后迅速將一側(cè)卵巢組織放入10%中性福爾馬林中固定，另一側(cè)放入液氮中冷凍備用。

3.血清E2、孕酮濃度測定：收集大鼠靜脈血于采血管中，室溫靜置一段時(shí)間后2 500g離心15 min，移取血清于1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存待測。利用孕酮、E2檢測試劑盒檢測血清孕酮和E2水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

4.卵巢組織蛋白質(zhì)提取及定量：大鼠灌胃28 d后，于發(fā)情間期處死，取大鼠卵巢組織，將組織剪碎后加入組織裂解液及蛋白酶抑制劑，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將組織進(jìn)一步打碎，冰上繼續(xù)裂解30 min后，4℃ 16 000g離心15 min，收集上清，利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

5.Western Blot檢測：蛋白變性后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，然后將其轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。電轉(zhuǎn)結(jié)束后用5%脫脂奶粉封閉1 h，所有一抗均按照1∶1 000稀釋后4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗;所有二抗均按照1∶2 000稀釋后室溫孵育1 h，PBST漂洗，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。利用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PCNB亞急性暴露對大鼠一般情況及卵巢系數(shù)的影響

灌胃期間各組大鼠毛發(fā)、粘膜和自主活動(dòng)等一般情況良好，未出現(xiàn)異?；蛩劳?。在PCNB亞急性暴露期間，高、低劑量組大鼠的體重變化、卵巢系數(shù)與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

A：體重變化情況；B：卵巢系數(shù)圖1 PCNB亞急性暴露后SD大鼠體重及卵巢系數(shù)的變化情況

二、PCNB亞急性暴露對SD大鼠血清孕酮和E2水平的影響

電化學(xué)發(fā)光法檢測發(fā)現(xiàn)，高、低劑量組大鼠血清孕酮水平均顯著高于對照組，血清E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖2)。

三、PCNB亞急性暴露對大鼠卵巢組織StAR、P450scc和Aromatase表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果顯示，大鼠卵巢組織中StAR的表達(dá)量低劑量組>高劑量組>對照組，各組組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；大鼠卵巢組織中P450scc表達(dá)量高劑量組>對照組>低劑量組，各組組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低、高劑量組大鼠卵巢組織中Aromatase表達(dá)水平均顯著低于對照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性下降(圖3)。

A：孕酮；B：E2。與對照組比較，*P<0.05圖2 亞急性暴露PCNB后SD大鼠血清孕酮及E2水平的變化

A：Western Blot檢測；B：灰度分析柱狀圖。與對照組比較，*P<0.05圖3 PCNB亞急性暴露后SD大鼠卵巢組織中StAR、P450scc和Aromatase表達(dá)情況

討 論

多項(xiàng)研究表明，卵巢是多種環(huán)境污染物的重要靶器官，環(huán)境因素是導(dǎo)致卵巢功能異常的重要原因之一[14]。作為一種常見的環(huán)境污染物，PCNB對卵巢功能影響的研究目前鮮少報(bào)道。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究了PCNB亞急性暴露對SD大鼠卵巢功能的影響。我們對不同劑量PCNB暴露后大鼠血清孕酮和E2水平進(jìn)行了檢測，結(jié)合卵巢甾體激素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)變化情況，初步探索了PCNB亞急性暴露對卵巢功能的影響及可能機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCNB亞急性暴露期間大鼠的一般情況良好，各實(shí)驗(yàn)組SD大鼠體重與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，提示PCNB亞急性暴露對SD大鼠無顯著系統(tǒng)毒性，這與Khera等[15]的研究結(jié)果一致。PCNB連續(xù)暴露28 d后各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清孕酮水平均顯著高于對照組，血清E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)。為探究PCNB亞急性暴露對甾體激素合成關(guān)鍵酶的影響，本研究檢測了各實(shí)驗(yàn)組SD大鼠卵巢組織中StAR、P450scc以及芳香化酶的表達(dá)情況。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組SD大鼠卵巢組織StAR的表達(dá)均上調(diào)，其中低劑量組>高劑量組，但各組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對照組比較，低劑量組大鼠卵巢組織中P450scc表達(dá)上調(diào)，高劑量組P450scc表達(dá)下調(diào)，但各組組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。甾體激素合成關(guān)鍵酶StAR和P450scc的表達(dá)量在低劑量組均高于高劑量組，這與大鼠血清孕酮水平的表達(dá)情況相一致。Western Blot結(jié)果提示，StAR及P450scc可能均在PCNB亞急性暴露導(dǎo)致的血清孕酮水平上調(diào)中發(fā)揮作用。芳香化酶作為卵巢組織合成E2的限速酶，PCNB暴露后其蛋白表達(dá)量顯著下降，這與血清E2水平下降相吻合，提示PCNB亞急性暴露可能通過下調(diào)芳香化酶的表達(dá)量而影響卵巢組織E2的分泌。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了PCNB暴露7 d對大鼠卵巢功能的影響，發(fā)現(xiàn)PCNB可顯著下調(diào)血清孕酮水平(P<0.05)，并導(dǎo)致血清E2水平下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[12]。這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCNB亞急性暴露引起大鼠血清孕酮升高、血清E2下降的結(jié)果不一致，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能與PCNB體內(nèi)暴露時(shí)間不一致有關(guān)；另外本次實(shí)驗(yàn)觀測終點(diǎn)時(shí)大鼠已進(jìn)入青春期，體內(nèi)參與激素調(diào)控的機(jī)制更為復(fù)雜，對甾體激素生成也可能產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)室前期研究均發(fā)現(xiàn)，PCNB暴露7 d顯著上調(diào)大鼠卵巢中StAR的表達(dá)[12]，本研究也檢測到PCNB亞急性暴露上調(diào)大鼠卵巢StAR的表達(dá)水平，提示StAR在PCNB暴露導(dǎo)致的卵巢甾體激素分泌紊亂中發(fā)揮了不可忽視的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PCNB暴露7 d可導(dǎo)致卵巢生長卵泡比例顯著升高，卵巢組織最大切面截面積增大[12]；本次實(shí)驗(yàn)觀察到PCNB暴露后導(dǎo)致SD大鼠卵巢系數(shù)增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示PCNB亞急性暴露可能對大鼠卵巢發(fā)育產(chǎn)生一定影響。

PCNB進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，可產(chǎn)生包括五氯苯酚、五氯硫酚、五氯硫島代苯甲醚在內(nèi)的多種代謝物質(zhì)[16]，其中的某些代謝產(chǎn)物如五氯苯酚可導(dǎo)致黃體功能不全、卵泡發(fā)育異常等不良后果，損傷卵巢正常功能[17-18]，提示PCNB可通過其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物對卵巢功能產(chǎn)生不良影響。另外由于生產(chǎn)工藝等的限制，PCNB中會(huì)含有微量六氯苯、二噁英等雜質(zhì)[19-20]，這些雜質(zhì)可在生物體內(nèi)蓄積，并影響血清甾體激素水平，干擾大鼠正常發(fā)情周期，降低雌性哺乳動(dòng)物生育力等[21-22]。目前尚不能排除PCNB含有的微量雜質(zhì)對卵巢功能的影響。此外肝臟作為代謝PCNB的主要臟器，PCNB暴露可造成肝臟損傷[23]，同時(shí)肝臟作為多種甾體激素轉(zhuǎn)化、降解的重要器官，它是否參與了亞急性暴露PCNB對甾體激素的影響有待進(jìn)一步的研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PCNB亞急性暴露后，可造成大鼠血清孕酮和E2表達(dá)水平的變化，并上調(diào)大鼠卵巢組織StAR蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)芳香化酶蛋白表達(dá)，這提示PCNB亞急性暴露可能通過影響甾體激素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)來影響雌孕激素的分泌，干擾卵巢正常功能，這為探究PCNB對生殖功能的毒性研究提供了新的參考。