失巢環(huán)境下腫瘤源性外泌體調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)機(jī)制研究

金霞云 柴華 朱忠權(quán) 李曉飛 藍(lán)志堅(jiān)

1 材料和方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所惠贈。改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液（批號：10829018，500 ml）購自美國 Gibco公司；Trizol試劑（批號：10296028，100 ml）和熒光定量 PCR試劑盒（批號：KK4611，10 ml）均購自日本 TaKaRa公司；CCK-8試劑盒（批號：AC11L113，1ml）、Edu試劑盒（批號：KTA2031，500T）和 AVPI檢測試劑盒（批號:40302ES20，200T）均購自北京碧云天試劑公司。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）抗體（批號：ab196609，100 μl）、凋亡相關(guān)因子 B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）（批號：ab117115，100 μl）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動子（Bad）（批號：ab90435，100 μl）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批號：ab13847，50 μl）均購自美國 Abcam 公司。polyHEMA試劑（批號：P3932，10G）購自瑞禧生物有限公司。

1.2 結(jié)腸癌抗失巢凋亡細(xì)胞株的獲取 采用95%乙醇溶液配置濃度為10 mg/ml的polyHEMA試劑。37℃水浴箱預(yù)熱處理，充分溶解polyHEMA試劑，然后將工作液均勻鋪在細(xì)胞培養(yǎng)板表面，形成表面的包被膜，然后置于65℃烤箱烘干。利用紫外線燈進(jìn)行消毒處理以備用。待結(jié)腸癌細(xì)胞的融合率達(dá)80%時，利用EDTA胰蛋白酶收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。按照1×105個/ml的細(xì)胞量接種于低黏附六孔板中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后收集懸浮的結(jié)腸癌細(xì)胞，5 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加入PBS溶液，制備單細(xì)胞懸液。按照1×105個/ml的細(xì)胞量接種于低黏附六孔板中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。如此反復(fù)培養(yǎng)7次后，最終獲得結(jié)腸癌的抗失巢凋亡細(xì)胞株。于懸浮培養(yǎng)12 h和24 h后利用顯微鏡下觀察抗失巢凋亡細(xì)胞株。

1.3 細(xì)胞凝集能力檢測 選取常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞和抗失巢凋亡細(xì)胞株制備細(xì)胞懸液，按照1×105個/ml接種于低黏附六孔板中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，6 h后利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的凝集團(tuán)細(xì)胞數(shù)量，計算凝集率，凝集率=視野下凝集細(xì)胞數(shù)/（視野下凝集細(xì)胞+單個細(xì)胞）×100%。

1.4 外泌體的提取 采用超速離心法收集抗失巢凋亡細(xì)胞和常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞的外泌體。將抗失巢凋亡細(xì)胞和常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞處理24 h后，棄上清液，利用PBS溶液清洗3次，更換無FBS的DMEM培養(yǎng)基，孵育48 h，收集細(xì)胞上清液，4℃、300 r/min，離心10 min，棄掉細(xì)胞碎片，收集上清液后再次離心，4℃、2000r/min，離心20 min，取上清液棄沉淀，重懸后經(jīng)0.22 μm濾器過濾，轉(zhuǎn)移至超速離心管中，4℃、10 000 r/min，離心70 min，取沉淀。PBS沖洗沉淀物，4 ℃、10 000 r/min，離心 70 min，重復(fù)3次，將得到的外泌體懸液于-80℃冰箱中保存。

1.5 透射電鏡觀察外泌體形態(tài) 取30 μl外泌體懸液，放置于栽樣銅網(wǎng)上，室溫下靜置3 min，加入3%磷鎢酸溶液30 μl，室溫下負(fù)染 5 min，室溫下孵育直至銅網(wǎng)干燥，然后透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。

1.6 外泌體標(biāo)志物CD63和CD81表達(dá)的檢測 采用Western blot法。將100 μl外泌體置于EP管中，利用1 ml PBS溶液進(jìn)行稀釋，冰上預(yù)冷10 s，加入RIPA裂解液后，提取總蛋白，利用BCA試劑盒確定蛋白濃度。按照SDS-PAGE說明書要求配置10%分離膠和5%濃縮膠，加入分離膠后加入分子梳。取30 μg蛋白質(zhì)上樣，先使用80 V電壓進(jìn)行電泳，待條帶跑至濃縮膠和分離膠的交接點(diǎn)后，改為120 V電壓。待條帶跑至分離膠底部，停止電泳。利用PVDF膜和濾紙進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置轉(zhuǎn)膜電流為200 mA，轉(zhuǎn)膜槽放至冰袋中低溫處理。轉(zhuǎn)膜成功后浸入封閉液中，搖床封閉2 h，加入CD63和CD81一抗稀釋液（1:10 000），4℃ 孵育過夜，TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入稀釋好的 HRP二抗溶液（1:2 000），孵育二抗，TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入Supersignal west femto試劑盒顯影液，分光發(fā)光成像分析儀顯影，出現(xiàn)蛋白條帶則為陽性。

1.7 結(jié)腸癌細(xì)胞攝取及內(nèi)化外泌體 將超速離心法提取的外泌體沉淀與1 ml的PBS溶液混合，利用超聲攪拌器重懸后保存。將4 μl的PKH67加入0.5 ml混懸液中，在室溫下孵育10 min。然后加入1 ml的10%BSA溶液，利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。然后利用超速離心法收集PKH67標(biāo)記的外泌體以備用。將結(jié)腸癌細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有蓋玻片的24孔板中，接種細(xì)胞量為3×105個/孔，待爬片細(xì)胞融合率＞60%時，利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。然后加入0.5 ml PKH67標(biāo)記的外泌體混懸液，放置在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再采用4%多聚甲醛溶液固定30 min，加入紅色CY3染液進(jìn)行細(xì)胞染色，避光孵育20 min后利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。再利用10 μg/ml的DAPI染液進(jìn)行染色，避光孵育15 min。利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。利用指甲油封片，加入防淬滅劑。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

包容性：中原文化具有兼容眾善、合而成體的特點(diǎn)。中原文化通過經(jīng)濟(jì)、戰(zhàn)爭、宗教、人口遷徙等眾多方式，實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)文化、制度文化和思想觀念的全面融合與不斷升華。鄭州大河村遺址中出土的一些富有山東大汶口文化特征的陶器，說明中原文化在那時就開始吸收周邊文化成果，熔鑄到自己的文化之中。胡服、胡樂、胡舞、胡食在漢唐間傳入中原，也都被吸收到中原文化之中。

1.8 細(xì)胞行為學(xué)檢測

1.8.1 細(xì)胞增殖率檢測 采用CCK-8法。將100 μl的外泌體懸液分別加入常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞和抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞中，在同一培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率＞50%后，將上述兩組細(xì)胞接種于96孔板中，100 μl/孔，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，然后每孔加入100 μl CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度（OD值）。檢測處理4、8、12、24 h后各組細(xì)胞的增殖率，細(xì)胞增殖率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%（As為實(shí)驗(yàn)孔 OD 值，Ac為對照孔 OD值，Ab為空白孔OD值）。

1.8.2 細(xì)胞增殖檢測 采用EdU法。外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，接種于預(yù)先鋪有玻璃片的96孔板中，100 μl/孔，在 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，加入50 μM的EdU試劑。避光孵育24 h后利用PBS溶液進(jìn)行清洗3次，5 min/次。加入100 μl的4%多聚甲醛溶液，室溫條件下孵育30 min，利用PBS溶液進(jìn)行清洗，5 min/次。加入 100 μl的 0.5% TritonX-100，用于對細(xì)胞膜的滲透。用PBS溶液清洗3次，5 min/次。加入100 μl的20%DAPI染液進(jìn)行核染處理。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞增殖情況，計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=視野下Edu染色陽性/視野下DAPI染色陽性×100%。

1.8.3 細(xì)胞凋亡檢測 采用雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV FITC-PI，AV-PI）檢測細(xì)胞凋亡。外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，利用EDTA蛋白酶收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS溶液清洗3次，5 min/次，300 r/min離心后取細(xì)胞沉淀，加入100 μl Bingding buffer進(jìn)行重置，然后根據(jù)AV-PI試劑盒說明書要求加入5 μl Annexin VFITC和10 μl PI染液。避光孵育30 min后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果包括四個象限：Q1：壞死細(xì)胞區(qū)；Q2：晚期凋亡細(xì)胞區(qū)；Q3：早期凋亡細(xì)胞區(qū)；Q4：活細(xì)胞區(qū)。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡（Q2+Q3）。

1.8.4 ERK5和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad和Caspase-3 mRNA表達(dá)的檢測 采用RT-PCR。外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，利用胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液清洗3次，5 min/次，常溫離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入1 ml Trizol溶劑，提取細(xì)胞總RNA，保證RNA純度范圍為1.8～2.1，然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，采用20 μl反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃保存，采用RT-PCR試劑盒的要求，采用FTC-2000 RTPCR系統(tǒng)和50 μg反應(yīng)體系對樣本DNA進(jìn)行分析，溶解曲線確定Tm值為53.7℃，統(tǒng)計并記錄各組樣本的CT 值，采用 2-ΔΔCt法對 ERK5 和凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、Bad、Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計。引物設(shè)計由上海生工公司設(shè)計，見表1。

表1 ERK5和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad、Caspase-3的引物序列

1.8.5 ERK5和凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bad和Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，收集各組細(xì)胞，加入1 ml RIPA細(xì)胞裂解液，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的離心管中，在預(yù)冷4℃的離心機(jī)中離心，預(yù)設(shè)：5 000 r/min，5 min后提取上清液，經(jīng)95℃煮沸后，收集蛋白備用。按照說明書制備濃縮膠10 ml，分離膠20 ml。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜后在4℃冰箱避光孵育過夜（＞12 h）。ERK5和Bcl-2、Bad、Caspase-3一抗經(jīng)一抗稀釋液1:5 000稀釋后加入樣本離子膜。第2天用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗經(jīng)二抗稀釋液1:1 000稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，而后用DAB顯影液處理樣本。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計和分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 失巢環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 結(jié)果顯示，利用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法可以培養(yǎng)失巢環(huán)境下的抗失巢凋亡細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，可見細(xì)胞凝集成團(tuán)。見圖1（插頁）。

圖1 失巢環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果（a：貼壁培養(yǎng)中的結(jié)腸癌細(xì)胞；b：懸浮培養(yǎng)12 h后結(jié)腸癌細(xì)胞；c：懸浮培養(yǎng)24 h后結(jié)腸癌細(xì)胞）

2.2 兩組細(xì)胞凝集能力的比較 結(jié)果顯示，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組細(xì)胞凝集率為（68.15±4.89）%，常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組為（23.21±3.46）%，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組細(xì)胞凝集能力要明顯高于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

圖2 抗失巢凋亡細(xì)胞的凝集能力檢測（a：常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組的凝集率檢測；b：抗失常凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組的凝集率檢測）

2.3 失巢環(huán)境培養(yǎng)下結(jié)腸癌細(xì)胞的外泌體鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示，外泌體為直徑50～150 nm的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)。Western blot結(jié)果顯示，外泌體的分子標(biāo)志物CD63和CD81表達(dá)陽性。見圖3。

圖3 失巢環(huán)境培養(yǎng)下結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體鑒定結(jié)果（a：電子顯微鏡下常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體和抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體的形態(tài)，×800；b：常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體和抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體中CD63和CD81的表達(dá)）

2.4 結(jié)腸癌細(xì)胞攝取及內(nèi)化PKH67標(biāo)記的外泌體鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示，失巢環(huán)境下提取的外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中，可見結(jié)腸癌細(xì)胞可以攝取并內(nèi)化PKH67標(biāo)記的外泌體。見圖4（插頁）。

圖4 結(jié)腸癌細(xì)胞攝取及內(nèi)化PKH67標(biāo)記的外泌體鑒定結(jié)果（a：結(jié)腸癌細(xì)胞染色；b：綠色PKH67標(biāo)記的外泌體；c：合并圖層）

2.5 兩組細(xì)胞增殖率的比較 結(jié)果顯示，處理4、8、12、24 h后，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞的增殖率明顯高于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組（均 P＜0.05），見表 2。

表2 兩組細(xì)胞增殖率的比較（%）

2.6 兩組細(xì)胞增殖能力的比較 結(jié)果顯示，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞的增殖能力[（23.76±2.57）%]明顯高于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組[（9.04±0.32）%]（P＜0.05），見圖5（插頁）。

圖5 Edu染色結(jié)果（a：常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組細(xì)胞的DAPI染色，Edu染色和合并圖層；b：抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組細(xì)胞的DAPI染色，Edu染色和合并圖層）

2.7 兩組細(xì)胞凋亡率的比較 結(jié)果顯示，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組的凋亡率為（0.080±0.030）%，常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組的凋亡率為（0.253±0.121）%，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯低于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.891，P＜0.05），見圖 6（插頁）。

圖6 AV-PI試劑盒檢測結(jié)果（a：常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡率；b：抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡率）

2.8 兩組細(xì)胞ERK5和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的mRNA相對表達(dá)水平的比較 結(jié)果顯示，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組的ERK5、Bad和Caspase-3的mRNA相對表達(dá)水平要明顯低于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組（均P＜0.05），而抗凋亡因子Bcl-2高于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組（P＜0.05），見表 3。2.9 兩組細(xì)胞ERK5和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平的比較 結(jié)果顯示，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞組的ERK5、Bad和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平要明顯低于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組（均P＜0.05），而抗凋亡因子Bcl-2高于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞組（P＜0.05），見表4。

表3 兩組細(xì)胞ERK5和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的mRNA相對表達(dá)水平的比較

表4 兩組細(xì)胞ERK5和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的蛋白相對表達(dá)量的比較（灰度值）

3 討論

腫瘤的復(fù)發(fā)與多種因素密切相關(guān)，比如癌基因和抑癌基因的突變，細(xì)胞外基質(zhì)的降解和免疫因素等[6-7]。但是，在腫瘤復(fù)發(fā)的過程中，腫瘤細(xì)胞會脫離原來的基質(zhì)環(huán)境，失去基質(zhì)黏附，處于失巢環(huán)境中，從而造成“失巢凋亡”[8-9]。既往研究表明，失巢環(huán)境中細(xì)胞凋亡率明顯改變，姜黃素、藤梨根等對于結(jié)腸癌的干預(yù)作用正是通過干預(yù)其失巢環(huán)境來調(diào)控結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)與耐藥性[10-11]。外泌體是一類雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)，可以由細(xì)胞分泌，攜帶大量的遺傳物質(zhì)，包括miRNA、lincRNA和各類基因等，通過膜融合和胞吞的方式，將遺傳信息傳遞至受體細(xì)胞中，從而影響受體細(xì)胞的生物學(xué)行為[12-13]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞和基底細(xì)胞之間可以通過外泌體進(jìn)行遺傳信息的交換[14]。因此，本研究主要目的是探究失巢環(huán)境來源的外泌體對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的生物功能密切相關(guān)，腫瘤微環(huán)境的變化可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等。隨著對腫瘤的進(jìn)一步研究，腫瘤所處的微環(huán)境也逐漸引起學(xué)者的關(guān)注[15-16]。腫瘤的復(fù)發(fā)與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，包括基質(zhì)降解、腫瘤細(xì)胞游走和腫瘤細(xì)胞再黏附。而在基質(zhì)降解、細(xì)胞游走的過程中，貼壁細(xì)胞會轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋〖?xì)胞，造成“失巢”的微環(huán)境[17]。有研究表明，在失巢環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生聚集，并且對細(xì)胞凋亡的程序性啟動產(chǎn)生一定的抵抗能力，叫做“抗失巢凋亡”[18]。直至細(xì)胞游走到新的附著環(huán)境中，然后重新附著后造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[19]。本研究證明，利用95%乙醇溶液配置濃度為10 mg/ml的polyHEMA試劑，形成表面的包被膜，構(gòu)建“失巢環(huán)境”，得到抗失巢凋亡細(xì)胞系。利用細(xì)胞凝集率檢測細(xì)胞的凝集能力，結(jié)果表明，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞凝集能力明顯高于常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞。與之前的研究結(jié)果相同。

外泌體是目前研究的熱點(diǎn)問題，細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與環(huán)境之間的交流可以通過外泌體攜帶相關(guān)的信號分子來實(shí)現(xiàn)。有研究表明，外泌體可以在細(xì)胞和微環(huán)境之間構(gòu)建一條“橋梁”，可以將微環(huán)境中的相關(guān)信息通過外泌體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，也可以將細(xì)胞內(nèi)的遺傳信號通過外泌體傳遞到細(xì)胞周圍微環(huán)境中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與周圍微環(huán)境的信號交流[20]。本研究結(jié)果顯示，失巢環(huán)境下提取的外泌體與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中，可見結(jié)腸癌細(xì)胞可以攝取并內(nèi)化PKH67標(biāo)記的外泌體，說明結(jié)腸癌可以內(nèi)吞外泌體，從而發(fā)揮作用。本研究利用CCK-8試劑盒、Edu試劑盒和AV-PI試劑盒檢測在常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體和抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體的刺激下結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力，結(jié)果表明，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。

Bcl-2和Bad與凋亡密切相關(guān)的基因，其中，Bad是促凋亡因子，而Bcl-2是抑制凋亡因子。而且，Caspase-3蛋白有“死亡蛋白”的說法，Caspase-3的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[21-22]。本研究通過RT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境中的外泌體可以從mRNA和蛋白兩個層面上抑制凋亡相關(guān)因子Bad和Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果說明，抗失巢凋亡結(jié)腸癌組外泌體可以抑制細(xì)胞的凋亡。本研究還利用AV-PI試劑盒檢測細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗失巢凋亡結(jié)腸癌組外泌體可以抑制細(xì)胞的凋亡。另外，筆者發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK5的表達(dá)水平在抗失巢凋亡結(jié)腸癌組外泌體刺激下，其mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均明顯下降。所以，筆者推測，外泌體對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控是通過ERK5信號通路。既往研究表明，ERK5信號通路可以介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和凋亡通路，與本研究結(jié)果相同。

綜上所述，抗失巢凋亡結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體可以通過ERK5信號通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。