土壤環(huán)境因子對(duì)棉花根際與內(nèi)生拮抗細(xì)菌存活數(shù)量的影響

黨文芳，劉萍，管力慧，楊紅梅，牛新湘，李萍，楚敏，婁愷，史應(yīng)武,3,6*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊830091；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830052；3.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091；4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊830091；5.新疆庫(kù)爾勒市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆庫(kù)爾勒841000；6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091）

隨著對(duì)生防微生物防病機(jī)制研究的不斷深入，生防微生物在農(nóng)田的高效應(yīng)用及其適應(yīng)土壤生境的生態(tài)學(xué)條件研究已成為熱點(diǎn)[1-5]。其中，生防微生物的生防效果取決于生防微生物菌劑應(yīng)用的生態(tài)環(huán)境條件及相應(yīng)農(nóng)作物的長(zhǎng)勢(shì)等觀點(diǎn)已經(jīng)明確。因此，篩選出適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的生防微生物菌株，并通過研究土壤環(huán)境對(duì)外源施入生防微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)生防微生物菌劑的合理開發(fā)和高效應(yīng)用具有重要的理論指導(dǎo)價(jià)值[6]。

目前，有關(guān)生防微生物的適應(yīng)性研究多限于探討其在植物植株中的定植變化規(guī)律及其定植后對(duì)植物生長(zhǎng)的影響和防病效果的研究，對(duì)復(fù)雜的土壤環(huán)境的適應(yīng)性及與其宿主相關(guān)性的報(bào)道還很少見，而生防微生物與復(fù)雜的農(nóng)田環(huán)境的關(guān)系決定了生防微生物的定植能力，進(jìn)而影響防治病害的效果及其田間實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[7-13]。筆者團(tuán)隊(duì)[14-15]前期從新疆棉田土壤中篩選出4個(gè)棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）的拮抗細(xì)菌菌株，鑒定為BacillusvelezensisBHZ-29（貝萊斯芽孢桿菌BHZ-29）、B.subtilisSHT-15（枯草芽孢桿菌SHT-15）、B.atrophaeusSHZ-24（萎縮芽孢桿菌SHZ-24）和B.vanilleaSMT-24（香草芽孢桿菌SMT-24）；與大麗輪枝菌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)菌株能通過減少大麗輪枝菌分生孢子形成、破壞大麗輪枝菌菌絲和孢子形態(tài)、導(dǎo)致大麗輪枝菌細(xì)胞膜破裂和降低大麗輪枝菌毒蛋白的含量等達(dá)到抑制病原菌的作用。王娜等[16]指出不同內(nèi)生細(xì)菌在棉花體內(nèi)的定植規(guī)律不同，且在棉苗中定植一定數(shù)量后才能對(duì)棉花黃萎病產(chǎn)生較高的防治效果。高毓晗等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌168被修復(fù)基因后其定植能力顯著上升，對(duì)番茄細(xì)菌性枯萎病和黃瓜鐮刀菌枯萎病的防效大幅上升[17-18]。據(jù)此，研究4個(gè)菌株在土壤環(huán)境中的適應(yīng)能力有助于發(fā)揮其防治棉花黃萎病的潛力。

為了充分發(fā)揮這4個(gè)菌株的應(yīng)用效果，本研究以此為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室條件下分析土壤理化性質(zhì)對(duì)其存活數(shù)量及活性的影響，揭示拮抗細(xì)菌在土壤不同理化條件下的適應(yīng)能力，為這些菌株進(jìn)一步高效防治棉花黃萎病應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1土樣。取自博樂（BL）、石河子（SHZ）、庫(kù)爾勒（KEL）試驗(yàn)地土壤。土壤的理化性質(zhì)由中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所測(cè)定。

表1 不同采樣地土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chem ical properties in different sam pling sites

1.1.2供試病原菌。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）菌株為2015-007，系強(qiáng)致病力菌株[19]，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)。

1.1.3供試拮抗細(xì)菌。供試菌株均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所史應(yīng)武研究員課題組篩選得到。其中，BHZ-29、SHZ-24分別從博樂、石河子棉株內(nèi)篩選得到，SHT-15、SMT-24均從石河子棉株根際土壤中獲得。

1.1.4供試棉花品種。新陸早36號(hào)由新疆石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所饋贈(zèng)。

1.1.5供試培養(yǎng)基。采用4種培養(yǎng)基試驗(yàn)，即營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nutrient broth,NB）培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar,NA）培養(yǎng)基，查比克（Czapek）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextroseagar,PDA）培養(yǎng)基。

1.1.6主要試劑。試劑包括尿素、磷酸二銨（二銨）、硫酸鉀、碳酸鈉、重碳酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉。以上試劑均為化學(xué)純?cè)噭?。配?.85%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉溶液。

1.1.7主要儀器。恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-211B型由上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司生產(chǎn)，超凈工作臺(tái)SWCGCO型由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，SPX-250BF-2型培養(yǎng)箱由上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)，YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1土樣的滅菌。同文獻(xiàn)[14]。

1.2.2病原菌發(fā)酵液制備。同文獻(xiàn)[14]。

1.2.3拮抗細(xì)菌發(fā)酵液制備。同文獻(xiàn)[14]。

1.2.4培養(yǎng)皿中理化因子試驗(yàn)方法。試驗(yàn)（1）～（5）以灰漠土為基礎(chǔ)進(jìn)行，量取病原菌1 m L、拮抗細(xì)菌3 m L，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入定量滅菌水或混合液于培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）中，搖勻后再稱取40 g滅菌土于培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)（30℃），每隔一段時(shí)間取土樣進(jìn)行拮抗細(xì)菌的活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)開始后，每天下午18：00用稱量法測(cè)定土壤含水量，補(bǔ)充當(dāng)天失去的水分，使各處理保持設(shè)定的含水率。

6個(gè)土壤理化因子的試驗(yàn)設(shè)置如下：（1）3個(gè)水分梯度，分別量取10 m L、15 m L、20 m L滅菌水于培養(yǎng)皿中。（2）3個(gè)溫度梯度，分別為15℃、25℃、30℃，放入培養(yǎng)箱中。（3）3個(gè)鹽分梯度，含鹽量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為0%、0.3%、0.6%（由碳酸鈉、重碳酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鈉7種鹽分等比例混入蒸餾水中滅菌后使用）。（4）3個(gè)肥力梯度，分別為T1、T2、T3，按1 kg土添加如下肥料，T1：尿素0.048g，二銨0.073g，硫酸鉀0.012 g；T2：尿素0.077 g，二銨0.128 g，硫酸鉀0.026 g；T3：尿素0.104 g，二銨0.182 g，硫酸鉀0.052 g。上述肥料混入蒸餾水中滅菌后使用。（5）3個(gè)pH梯度，用NaOH或鹽酸分別調(diào)滅菌水pH至5、7、9。（6）3個(gè)土壤類型，棕漠土（ZMT，取自新疆庫(kù)爾勒試驗(yàn)地）、灰漠土（HMT，取自新疆石河子試驗(yàn)地）、棕鈣土（ZGT，取自新疆博樂試驗(yàn)地）。

這6個(gè)土壤理化因子每個(gè)梯度下，用1.2.2的病原菌發(fā)酵液（孢子含量107m L－1）與1.2.3的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液[有效活菌數(shù)108CFU（菌落形成單位，Colony form ing unit）·m L－1]設(shè)置以下8個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每皿為1個(gè)重復(fù)，共有432個(gè)培養(yǎng)皿。8個(gè)處理：（1）拮抗細(xì)菌SHZ-24發(fā)酵液；（2）拮抗細(xì)菌SHT-15發(fā)酵液；（3）拮抗細(xì)菌SMT-24發(fā)酵液；（4）拮抗細(xì)菌BHZ-29發(fā)酵液；（5）病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌SHZ-24發(fā)酵液；（6）病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌SHT-15發(fā)酵液；（7）病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌SMT-24發(fā)酵液；（8）病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌BHZ-29發(fā)酵液。

1.2.5盆栽中土壤理化因子試驗(yàn)方法。試驗(yàn)（1）和（2）以灰漠土為基礎(chǔ)進(jìn)行，設(shè)置3個(gè)土壤理化因子：（1）3個(gè)水分處理。每隔1 d澆1次水，每缽10 m L；每隔2 d澆1次水，每缽10 m L；每隔3 d澆1次水，每缽澆10 m L。每隔3 d、2 d和1 d（每缽10 m L水）處理的土壤的含水率分別為10%、15%和20%。（2）設(shè)3個(gè)肥力處理，T1、T2、T3，肥料配方同1.2.4。施用時(shí)將肥料溶入水中澆灌棉苗，施用前將肥料溶入水，分4次灌入土壤：30%作基肥，1片真葉時(shí)施20%，棉苗生長(zhǎng)15 d時(shí)施30%，棉苗生長(zhǎng)30 d時(shí)施20%。試驗(yàn)期間各處理均灌溉無(wú)離子水。（3）3個(gè)土壤類型，分別為采自新疆庫(kù)爾勒（棕漠土）、石河子（灰漠土）、博樂（棕鈣土）的土壤。土壤滅菌后進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

棉苗盆栽種植及防效試驗(yàn)方法：將無(wú)菌土裝營(yíng)養(yǎng)缽2/3處，每筒種植4粒顆粒飽滿的棉種，覆土后撫平表層土壤，放入智能培養(yǎng)箱出苗，晝/夜光照時(shí)間與溫度13 h/11 h、26℃/24℃，光照強(qiáng)度6×104lx，培養(yǎng)箱內(nèi)相對(duì)濕度60%。用1.2.2的病原菌發(fā)酵液（孢子含量107m L－1）與1.2.3的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（108CFU·m L－1）設(shè)置7個(gè)處理。（1）空白處理；（2）僅傷根；（3）傷根＋病原菌發(fā)酵液；（4）傷根＋病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌SHZ-24發(fā)酵液；（5）傷根＋病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌SHT-15發(fā)酵液；（6）傷根＋病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌SMT-24發(fā)酵液；（7）傷根＋病原菌發(fā)酵液＋拮抗細(xì)菌BHZ-29發(fā)酵液。每個(gè)處理至少做3個(gè)重復(fù)。在播種一定時(shí)間后接種生防細(xì)菌和病原菌，調(diào)查防病效果。

1.2.6接種方法。播種后18 d左右棉苗1片真葉初現(xiàn)時(shí)，每缽棉苗接種拮抗細(xì)菌發(fā)酵液30 m L（直接將108CFU·m L－1注入棉株）。5 d后將長(zhǎng)至兩葉一心的棉苗距根底部2～3 cm處用剪刀人工傷根，每缽棉株傷根處灌溉病原菌發(fā)酵液（孢子含量107m L－1）10 m L。棉苗置于智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d澆1次水，每缽10 m L。白天培養(yǎng)箱內(nèi)溫度控制在25℃，夜間溫度控制在22℃，土壤相對(duì)濕度控制在60%以上，光照良好。

1.2.7拮抗細(xì)菌在土壤生境中的活菌數(shù)量的測(cè)定。采用平板菌落計(jì)數(shù)法[20]計(jì)算土壤中拮抗細(xì)菌的數(shù)量。接種拮抗細(xì)菌后開始取樣，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取3株棉苗根部土壤，挖取棉株根部土壤，混勻（培養(yǎng)皿取樣時(shí)，每皿選取3個(gè)部位挖取土壤），測(cè)量土壤的含水率后，稱量5 g土壤于250 m L三角瓶中，加入滅菌生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%）45 m L，25℃、180 r·m in－1振蕩2 h，再用梯度稀釋法進(jìn)行稀釋，將土壤原液稀釋至10-4、10-5梯度后涂布在NA固體培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫箱培養(yǎng)1 d，記錄每皿細(xì)菌菌落數(shù)量，剔除雜菌并計(jì)算每克土壤中細(xì)菌數(shù)量。計(jì)算活菌數(shù)的相對(duì)數(shù)量（rN）：rN＝（N0－N1）/N0。式中，N0為對(duì)照組活菌數(shù)絕對(duì)數(shù)量，N1為試驗(yàn)組活菌數(shù)絕對(duì)數(shù)量。

1.2.8防病效果調(diào)查。棉花黃萎病發(fā)生情況調(diào)查方法同文獻(xiàn)[15]。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，外表無(wú)癥狀；1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)，病葉占總?cè)~片數(shù)比例分別為（0,25%]、（25%,50%]、（50%,75%]、（75%,100%]。病情指數(shù)（DI）計(jì)算公式：DI＝∑（DG×NDG）/（DGmax×NT）×100。式中，DG為病級(jí)，NDG為相應(yīng)病級(jí)發(fā)病株數(shù)，DGmax為最高病級(jí)（4），NT為調(diào)查總株數(shù)。1.2.9數(shù)據(jù)處理與分析。采用MSExcel、Graph-Pad Prism 6和IBM SPSSStatistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)皿中土壤理化性質(zhì)對(duì)拮抗細(xì)菌存活數(shù)量的影響

對(duì)培養(yǎng)10 d時(shí)不同理化因子下拮抗細(xì)菌的存活數(shù)量進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表2）表明，在6個(gè)土壤理化因子中，土壤含水率、土壤肥力和土壤類型對(duì)4株菌存活數(shù)量的影響均顯著（P＜0.05）；土壤pH、土壤含鹽量、土壤溫度對(duì)SMT-24、SHT-15和BHZ-29存活數(shù)量的影響顯著（P＜0.05），但對(duì)SHZ-24存活數(shù)量的影響不顯著（P＞0.05）。選擇對(duì)4株拮抗細(xì)菌影響均顯著的土壤因子進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，進(jìn)一步明確在不同土壤含水率、土壤肥力和土壤類型下4株拮抗細(xì)菌在棉苗根部的定植能力及對(duì)棉花黃萎病的防病效果。

2.2 盆栽土壤理化因子對(duì)拮抗細(xì)菌存活的影響

2.2.1土壤肥力對(duì)拮抗細(xì)菌相對(duì)數(shù)量的影響。在同一處理時(shí)間，不同土壤肥力處理下土壤中各菌株的活菌相對(duì)數(shù)量存在顯著差異 （P＜0.05）。BHZ-29菌株在3種土壤中活菌相對(duì)數(shù)量最高，T2肥力處理40 d時(shí)為24.81%，SHZ-24和SHT-15菌株次之，40 d時(shí)活菌相對(duì)數(shù)量分別為1.69%和1.83%；SMT-24菌株在土壤中活菌相對(duì)數(shù)量最低，T3、T2、T1肥力處理下40 d時(shí)分別為0.59%、0.92%和0.79%（圖1）。SHZ-24和SMT-24菌株在不同土壤肥力處理下活菌相對(duì)數(shù)量相差不大，SHZ-24在1.4%～2.8%，SMT-24在0.5%～1.3%。SHT-15菌株在整個(gè)時(shí)期內(nèi)在T2肥力處理的土壤中活菌相對(duì)數(shù)量最高，10 d、20 d、30 d和40 d時(shí)分別達(dá)到了2.3%、1.77%、2.24%和1.83%，在整個(gè)監(jiān)測(cè)時(shí)期內(nèi)變化趨勢(shì)平穩(wěn)。在T3肥力下10 d以后，BHZ-29菌株活菌相對(duì)數(shù)量呈先減小后增大的趨勢(shì)，T2肥力下呈先增大后減小的趨勢(shì)，T1肥力下呈持續(xù)減小的趨勢(shì)。BHZ-29菌株在整個(gè)時(shí)期內(nèi)在T2肥力處理的土壤中相對(duì)數(shù)量最高。

2.2.2土壤類型對(duì)拮抗細(xì)菌相對(duì)數(shù)量的影響。在同一時(shí)間，不同土壤類型處理下土壤中各菌株的菌落相對(duì)數(shù)量存在顯著差異（P＜0.05）。在不同土壤類型中，BHZ-29菌株在土壤中活菌相對(duì)數(shù)量最高，棕漠土處理下40 d時(shí)為15.24%；SHZ-24和SHT-15菌株次之，棕鈣土中40 d時(shí)活菌相對(duì)數(shù)量分別為2.15%和3.07%；SMT-24菌株活菌相對(duì)數(shù)量在土壤中最低，灰漠土、棕鈣土、棕漠土肥力處理下40 d時(shí)分別為0.27%、1.06%和0.63%（圖2）。SMT-24菌株活菌相對(duì)數(shù)量在3種類型土壤中相差不大，其相對(duì)數(shù)量在0.5%～1.3%，在棕鈣土中均呈先增大后減小的趨勢(shì)。SHT-15菌株活菌相對(duì)數(shù)量在棕鈣土中呈先減小后增大的趨勢(shì)，在灰漠土和棕漠土中呈先增大后減小的趨勢(shì)。BHZ-29菌株活菌相對(duì)數(shù)量在灰漠土呈先增大后減小的趨勢(shì)，在棕鈣土和棕漠土中呈先減小后增大的趨勢(shì)，40d時(shí)分別達(dá)到13.32%和15.24%。

表2 4株拮抗細(xì)菌在不同土壤理化因子下的菌落存活數(shù)量方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of the variance of the number of surviving antagonistic bacteria under different soil physical and chem ical factors

圖1 4株棉花黃萎病菌拮抗細(xì)菌在4種不同土壤肥力下的活菌相對(duì)數(shù)量變化Fig.1 Variation of the relative quantity of four antagonistic bacterial isolates against Verticillium dahliae in four different soil fertilities

2.2.3土壤含水率對(duì)拮抗細(xì)菌相對(duì)數(shù)量的影響。在同一時(shí)間，不同土壤含水率下土壤中各菌株的菌落相對(duì)數(shù)量存在顯著差異（P＜0.05）。在不同土壤含水率下，SHZ-24菌株在土壤中活菌相對(duì)數(shù)量最大，15%含水率下30 d時(shí)達(dá)到27.74%，且在20%和15%含水率下均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)；SHT-15菌株，在15%和20%含水率下活菌相對(duì)數(shù)量呈持續(xù)減小的趨勢(shì)，10%含水率下呈先減小后增大的趨勢(shì)，30 d時(shí)為10.85%；在3種含水率下，土壤中SMT-24菌株活菌相對(duì)數(shù)量相差不大；BHZ-29菌株在10%含水率的土壤中活菌相對(duì)數(shù)量呈先增大后減小的趨勢(shì)，且均高于含水率為15%和20%的土壤，在30 d時(shí)達(dá)到12.85%（圖3）。

2.2.4土壤肥力對(duì)拮抗細(xì)菌防效的影響。4株拮抗細(xì)菌在不同肥力處理后20 d時(shí)，棉苗在T3土壤中長(zhǎng)勢(shì)良好，發(fā)病程度較弱；T2處理的棉苗發(fā)病較嚴(yán)重；T1處理的棉苗葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀，發(fā)病最重。此時(shí)，同一拮抗細(xì)菌對(duì)棉花黃萎病的防效，在不同肥力處理間均表現(xiàn)顯著差異（圖4）。T3肥力處理4種拮抗細(xì)菌處理對(duì)棉花黃萎病的防效最好，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29的防效分別為62.12%、63.64%、65.91%和87.12%；T1肥力處理下防效最差，分別為40.77%、44.89%、55.72%和53.87%；T2肥力處理下防效居中，分別為50.02%、51.59%、41.91%和66.89%。

2.2.5 土壤類型對(duì)拮抗細(xì)菌防效的影響。4株生防細(xì)菌處理后20 d時(shí)，不同土壤中棉苗子葉均已發(fā)病，部分真葉發(fā)病。此時(shí)，同一拮抗細(xì)菌對(duì)棉花黃萎病的防效在不同土壤類型間均表現(xiàn)顯著差異（圖5）?；夷林?，SHZ-24和BHZ-29菌株防效最好，其防效分別達(dá)到了49.17%和44.75%；棕鈣土中，BHZ-29菌株防效最好，達(dá)到60.87%；棕漠土中，SHZ-24菌株的防效最好，達(dá)到45.50%。

圖2 4株棉花黃萎病拮抗細(xì)菌在3種類型土壤下的活菌相對(duì)數(shù)量變化Fig.2 Variation of relative quantity of four antagonistic bacterial isolates against Verticillium dahliae in three types of soil

2.2.6土壤含水率對(duì)拮抗細(xì)菌防效的影響。4株拮抗細(xì)菌處理后20 d時(shí)，含水率15%和20%處理的棉苗長(zhǎng)勢(shì)良好，發(fā)病程度較弱；10%處理的棉苗葉片多數(shù)脫落，只剩頂端的2片真葉。此時(shí)，在不同土壤含水率下，同一拮抗細(xì)菌處理對(duì)棉花黃萎病的防效差異顯著（圖6）。在含水率10%和15%的條件下，拮抗細(xì)菌SHZ-24、SHT-15和BHZ-29防效較好，其中SHZ-24處理為53.74%和55.56%，SHT-15處理為52.76%和52.17%，BHZ-29處理為57.16%和58.45%。4株拮抗細(xì)菌在含水率為20%的土壤條件下相較其他2個(gè)含水率下棉花黃萎病的發(fā)病程度重。不同水分處理中，SMT-24菌株防效最差，10%、15%和20%的含水率下分別為35.04%、43.96%和37.55%。

3 討論

圖3 在不同土壤含水率下4株棉花黃萎病拮抗細(xì)菌的活菌相對(duì)數(shù)量變化Fig.3 Variation of the relative quantity of four antagonistic bacterial isolates against Verticillium dahliae in the soil with different water contents

多數(shù)植物病害的拮抗微生物是從土壤特別是植物根際土壤分離的，由于這些拮抗微生物易受土壤中各種條件的影響，在土壤中的存活能力差，導(dǎo)致其防病效果不穩(wěn)定，無(wú)法達(dá)到持續(xù)防治的作用[21]。目前，有關(guān)拮抗微生物的防病機(jī)制研究著重在拮抗物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)及系統(tǒng)誘導(dǎo)三個(gè)方向，這些機(jī)制并非相互排斥，通過單一或共同作用達(dá)到防病效果[22]。同時(shí)生防微生物能否成為較好防治棉花黃萎病的微生物菌劑的有效成分，除拮抗微生物具有較好的防病機(jī)制外，更重要的是要有對(duì)土壤較好的適應(yīng)性[6]。還有研究指出，土壤水分的流動(dòng)會(huì)影響拮抗細(xì)菌的分布，土壤水分的差異會(huì)影響拮抗細(xì)菌在土壤中的存活[23]。本研究表明土壤含水率、土壤肥力和土壤類型對(duì)供試的4株棉花黃萎病拮抗細(xì)菌在土壤中的存活能力影響顯著，且顯著影響其對(duì)棉花黃萎病的效果，說(shuō)明拮抗細(xì)菌要充分發(fā)揮防病作用，對(duì)土壤類型、含水率、肥力具有選擇性。這與前人研究結(jié)果一致，也為如何高效使用拮抗細(xì)菌提供的理論指導(dǎo)。本研究還發(fā)現(xiàn)SHZ-24和BHZ-29菌株在土壤中存活率較大且其防病效果較好，而李雪艷[14]指出SMT-24菌株抑菌效果最好，其次為BHZ-29菌株，SHT-15與SHZ-24較差。表明盡管SMT-24抑菌效果較好，但其在土壤中的存活能力較差，進(jìn)而導(dǎo)致其防病效果并非最優(yōu)。這一點(diǎn)正好驗(yàn)證了拮抗細(xì)菌在土壤中的存活能力是該菌株發(fā)揮生防效果的條件之一。與Chinawoeng等[24]的研究結(jié)果——具有良好拮抗效果的假單胞菌PCL1391在番茄根際的存活能力是該菌株發(fā)揮生防效果的條件之一——相符。有研究指出土壤酶能夠反映土壤質(zhì)量在時(shí)間或各種不同條件下的變化，改變土壤理化性質(zhì)、肥力狀況等會(huì)顯著影響土壤酶的活性[25-27]，進(jìn)而影響拮抗細(xì)菌在土壤中的存活能力及對(duì)棉花黃萎病的防病效果。土壤環(huán)境復(fù)雜多樣，土壤的活菌計(jì)數(shù)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且準(zhǔn)確性較低；因此，從土壤酶活性入手，明確生防菌適應(yīng)土壤環(huán)境的機(jī)理，進(jìn)而為改善生防細(xì)菌的防病效果提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，值得研究。

圖4 不同土壤肥力下4種拮抗細(xì)菌防治棉花黃萎病的效果Fig.4 Control effects of the four antagonistic bacterial isolates to cotton Verticillium w ilt under different soil fertilities

圖5 不同土壤類型對(duì)4種生防細(xì)菌防治棉花黃萎病效果的影響Fig.5 Effects of different soil types on the four biocontrol antagonistic bacterial isolates to control cotton seed ling Verticillium w ilt

圖6 不同土壤含水率對(duì)4種生防細(xì)菌防治棉花黃萎病的影響Fig.6 Effects of different soil water contents on four antagonistic bacterial isolates to control cotton Verticillium w ilt

本研究探討了土壤理化環(huán)境對(duì)拮抗細(xì)菌存活的影響，可為拮抗細(xì)菌菌株的合理使用及其制劑加工工藝研究提供支持。但拮抗細(xì)菌菌株的防效與拮抗菌株的使用方法、劑量及使用時(shí)間等密切相關(guān)，所以這些拮抗細(xì)菌的高效使用技術(shù)需要進(jìn)一步研究明確。

4 結(jié)論

以4株棉花黃萎病拮抗細(xì)菌為研究對(duì)象，明確了不同理化因子、土壤含水率、土壤肥力和土壤類型對(duì)其存活及防病效果的的影響。SHZ-24和BHZ-29菌株在土壤中活菌相對(duì)數(shù)量較高，其中SHZ-24在15%的土壤含水率下達(dá)到27.74%，BHZ-29菌株在中等肥力、灰漠土中分別達(dá)到24.81%和15.24%；在高肥力、土壤含水率小于20%的土壤條件下，4株拮抗細(xì)菌對(duì)棉花黃萎病的防效較好；BHZ-29防效最高可達(dá)87.12%，SMT-24防效最低僅為35.04%。