基于16S rRNA 測序探究杜洛克豬飼料利用率與腸道菌群的關(guān)系

田威龍，司景磊，莫家遠(yuǎn)，劉笑笑，程 鋒，呂冬玲，李月月，陳奎蓉，梁 靚，蘭干球，梁 晶

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004）

豬在我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖中占有重要地位，據(jù)《中華人民共和國2019 年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計公報》顯示，2019 年我國豬肉產(chǎn)量雖同比下降21.3%，但仍達(dá)4 255 萬t。成本核算發(fā)現(xiàn)，飼料成本占整個養(yǎng)豬生產(chǎn)成本的60% 以上，同時由于豬飼料是玉米-豆粕型飼料，這在一定程度上導(dǎo)致了豬用糧食增加，因此提高飼料利用率是生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路。遺傳、疾病、飲食和管理等諸多因素都會影響豬的飼料利用率[1-3]。近年來隨著測序技術(shù)的發(fā)展以及對豬的腸道微生物組的研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群是食物消化的重要貢獻(xiàn)者，影響宿主的整體生理生長、免疫反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制，對豬的飼料利用率產(chǎn)生重要影響[4-5]。Tan 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高、低飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）長白豬腸道不同位置存在的差異微生物，揭示了與FCR 相關(guān)的潛在腸道微生物標(biāo)志物。Mccormack 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼料利用效率更高的雜交豬中有益細(xì)菌的相對豐度較高，尤其是梭菌和擬桿菌屬的成員；而紅球菌和紅藻菌等潛在有害細(xì)菌的相對豐度較低，表明腸道菌群與飼料利用效率密切相關(guān)。因此，了解豬腸道菌群的組成和差異可為通過調(diào)節(jié)腸道微生物的群落、提高豬飼料利用效率提供一定策略。本研究以杜洛克為研究對象，探索高FCR 和低FCR 豬腸道微生物的組成和差異，為進(jìn)一步挖掘與豬飼料利用率密切相關(guān)的腸道微生物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)與樣品收集 試驗所用91 頭美系純種杜洛克公豬來自廣西南寧市某核心育種場。仔豬斷奶后，同時轉(zhuǎn)移至相同保育條件下飼養(yǎng)，并在30 日齡時轉(zhuǎn)移至同一育肥舍，使用奧斯本自動喂料系統(tǒng)對豬的采食量和體重進(jìn)行測定。對所有試驗豬提供相同的玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧（NRC，2012），其組成及營養(yǎng)成分見表1。測定期間自由飲水與采食，未使用任何抗生素或藥物。當(dāng)達(dá)到（80±1.5）日齡時，采集個體新鮮糞便樣品，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存至使用。

表1 育肥豬基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)成分

1.2 飼料利用率計算和分組 利用從奧斯本自動喂料系統(tǒng)中導(dǎo)出的測定期間所有豬只的采食量數(shù)據(jù)和在初測和結(jié)測時稱量個體體重數(shù)據(jù)，依據(jù)《全國種豬遺傳評估方案(試行)》校正公式計算出校正30～100 kg FCR 并對FCR 進(jìn)行排序，將FCR 數(shù)值最低的10 只豬作為LFCR組，將FCR 數(shù)值最高的10 只豬作為HFCR 組。

1.3 糞便DNA 的提取和測序 參照 FastDNA SPIN soil kit（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA）試劑盒說明書提取糞便基因組DNA。提取的DNA 使用微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000，美國）測量DNA濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基 V3-V4 區(qū)，引物為通用引物（F：338F，5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R，5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。擴(kuò)增條件：98℃初始變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)數(shù)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司使用IlluminaMiseq 平臺測序。

1.4 生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計 利用 QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）（version 1.9.1）對16S rRNA 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，使用USEARCH 軟件軟件（version7.0）按相似度≥97% 的序列配給相同的操作分類單位（OTU）；RDP Classifier 貝葉斯算法（version 2.11）對OTUs 序列分類注釋；使用 R 語言對糞便菌群門和屬水平的 PCoA 進(jìn)行分析，并由STAMP 軟件（version 2.1.3）可視化；用Mothur 軟件（version 1.30.2）計算Alpha 指數(shù)，包括Sobs、Shannon、ACE、Chao1；利用PICRUSt 對OTUs 豐度標(biāo)準(zhǔn)化，并將每個標(biāo)準(zhǔn)化的OTU 對應(yīng)到相應(yīng)的 Greengenes，獲得相應(yīng)的KEGG信息，并用STAMP 對豐度化的KEGG 進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果

2.1 樣本飼料利用率統(tǒng)計 如表2 所示，LFCR 組的FCR為1.661～1.919，平均為1.830，說明其飼料利用效率高；HFCR 組的FCR 為2.397～2.621，平均為2.469。HFCR組和LFCR 組豬的校正30～100 kg FCR 差異極顯著。

表2 HFCR 組和LFCR 組豬的FCR 表型

2.2 樣本序列信息 HFCR 組獲得441 444 個16S rRNA基因序列，LFCR 組獲得483 951 個16S rRNA 基因序列，共925 395 個。基于每個樣品的OTU 指數(shù)得到所有樣品的稀釋性曲線（圖1），Shannon 指數(shù)和Sobs 指數(shù)曲線上升后均逐步趨于平穩(wěn)，說明本試驗樣品測序深度能覆蓋腸道菌群的大部分菌種，結(jié)果可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 Shannon 指數(shù)曲線（A）Sobs 指數(shù)曲線（B）分析

2.3 Alpha 多樣性分析 本研究以細(xì)菌物種的多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）、豐富度指數(shù)（Chao1、ACE）、測序覆蓋率指數(shù)（Coverage）作為豬腸道微生物Alpha 多樣性的參數(shù)，結(jié)果顯示，HFCR 和LFCR 組間Alpha 多樣性指數(shù)均無顯著性差異（表3）。

表3 杜洛克豬不同樣本的Alpha 多樣性

2.4 基于門和屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成 在門水平上，共鑒定到14 個門水平菌，其中HFCR 和LFCR 組共有門有13 個（92.86%），LFCR 組有1 個獨有菌門為p__Fusobacteria（圖2-A）。2 組均檢測到2 個優(yōu)勢門（圖2-C），分別為Fimicutes（HFCR 組占69.57%，LFCR 組占73.01%）和Bacteroidetes（HFCR 組占26.83%，LFCR 組占22.51%），均占據(jù)了各組總數(shù)的95%以上。在屬水平上（圖2-B），共鑒定到114 個屬水平菌，其中HFCR 和LFCR 組共有的屬有110 個，HFCR 組有1個特有的屬為g_unclassified_f_Bacteroidaceae，LFCR組有3 個特有的屬為g_Fusobacterium、g_1-68、g_unclassified_f_Planococcaceae。2 組均檢測到4 個優(yōu)勢屬，分別為Prevotella（HFCR 組占15.22%，LFCR 組占14.20%）、norank_f_Ruminococcaceae（HFCR 組 占11.13%，LFCR 組占9.82%）、Lactobacillus（HFCR 組占10.97%，LFCR 組占9.90%）和norank_f_Lachnospi raceae（HFCR 組占7.42%，LFCR 組占4.54%）（圖2-D）。

圖2 HFCR 和LFCR 組的微生物群落結(jié)構(gòu)組成

2.5 基于門和屬水平的微生物組成差異 利用主坐標(biāo)（Principal co-ordinates analysis，PCoA）比 較HFCR和LFCR 組微生物在門和屬水平上的組成，從PCoA 結(jié)果顯示，在門和屬水平上微生物組成均未依據(jù)FCR 表型明顯分為2 組（圖3）。采用LEfSe 分析比較HFCR和LFCR 組之間菌群差異性，分支圖顯示了HFCR 和LFCR 組中在微生物的門、綱、目、科、屬分類水平上最豐富的微生物群體（圖4-A），共發(fā)現(xiàn)23 個差異項，其中14 個在LFCR 組中富集，9 個在HFCR 組中富集，LFCR 組中的差異項多于HFCR 組。LDA 分析（圖4-B）結(jié)果顯示，14 個在LFCR 組中富集的菌群分別為p_Actinobacteria、g_Collinsella、f_Enterobacteriaceae、o_Enterobacteriales、g_norank_f_Enterobacteriaceae、g_1-68、g_staphylococcus、g_Staphylococcus、g_norank_o_Streptophyta、c_Chloroplast、o_Streptophyta、f_norank_Streptophyta、f_tissierellaceae、o_bacillales、Streptococcus、Christensenellaceae、Ruminococcaceae，9 個在HFCR 組中富集的菌群分別為g_unclassif ied_o_Bacteroidales、f_unclassif ied_o_Bacteroidales、g_rc4-4、p_WPS-2、g_norank_p_WPS-2、o_norank_p_WPS-2、f_norank_p_WPS-2、c_norank_p_WPS-2、g_unclassified_f_Ruminococcaceae。

圖4 HFCR 和LFCR 組微生物差異分析

圖3 門水平（A）和屬水平（B）的 PCoA 分析

在門、屬水平比較HFCR 和LFCR 組前150 種微生物類群存在顯著差異的微生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在門水平（圖5-A），WPS-2 在HFCR 組中的豐度顯著高于LFCR 組；在屬水平上（圖5-B），unclassified_f_Ruminococcaceae、unclassified_o_Bacteroidales、norank_p_WPS-2和rc4-4在HFCR 組中的豐度顯著高于LFCR 組，Collinsella、norank_f_Enterobacteriaceae、Staphylococcus、1-68和norank_o_Streptophyta在LFCR 組中的豐度顯著高于HFCR 組。

圖5 在門水平（A）和屬水平（B）的差異菌群

2.6 杜洛克豬腸道微生物組功能預(yù)測分析 基于PICRUSt分析平臺的16S 功能預(yù)測將獲得的OTU 豐度表與Greengene 數(shù)據(jù)庫比對，獲得相應(yīng)的COG 及KO 功能信息及其豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杜洛克豬腸道微生物組功能主要集中于Amino acid transport and metabolism、Carbohy drate transport and metabolism、Transcription、Cell wall/membrane/envelope biogenesis、General function prediction only 等方面（圖6-A、6-B），高低組無明顯差異；KEGG預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，HFCR 組和LFCR 組無顯著的差異，基因主要富集Amino sugar and nucleotide sugar metabolism、purine metabolism、Glycolysis/Gluconeogenesis、Pyrimi dine metabolism 等功能通路（圖6-C）。

圖6 HFCR 和LFCR 組豬糞便微生物功能代謝通路分析

3 討 論

由于我國本地豬種基本都是脂肪型豬，具有耐粗飼和抗病能力強(qiáng)等優(yōu)點，但存在瘦肉率低、生長速度慢和飼料利用率低等問題，因此為了適應(yīng)現(xiàn)代生豬產(chǎn)業(yè)的要求，我國大量引進(jìn)西方商業(yè)豬種，以改良本地品種或者直接進(jìn)行繁育作為商品豬，其中杜洛克通常作為最重要的終端父本使用。杜洛克在配套系中作為父本主要是其具有生長速度快、瘦肉率高、飼料利用率高等優(yōu)良的生長性狀，這也是杜洛克在育種工作中的主要育種目標(biāo)。飼料利用率受飲食、遺傳等眾多因素的影響，而這些因素恰恰也是腸道菌群的重要影響因素。新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)極大擴(kuò)展了人們對于腸道微生物的認(rèn)識，豬的腸道微生物與豬健康和生長效率之間的關(guān)系也越來越受到關(guān)注。前人發(fā)現(xiàn)當(dāng)仔豬出生后，暴露在各種環(huán)境條件下，大量細(xì)菌開始在體內(nèi)定殖，但是其腸道菌群組成會隨著時間的推移而不斷變化，而不是一成不變[8]；尤其是在斷奶后，由于飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，腸道菌群的組成會發(fā)生很大的改變[9]；而腸道微生物群和糞便微生物群之間具有密切的關(guān)系，可以通過糞便微生物的群落變化反映腸道菌群的改變[10]。所以本研究利用16S rRNA 測序技術(shù)探究糞便菌群與杜洛克飼料利用率的關(guān)系，為進(jìn)一步利用腸道菌群提高飼料利用率提供參考依據(jù)。

有研究表明，腸道微生物與豬的生長性狀具有一定聯(lián)系[7]。本研究中試驗豬均飼養(yǎng)在同一育肥舍，飼喂相同的育肥日糧，采取相同的飼養(yǎng)方式，盡可能減少外界環(huán)境因素對于腸道菌群的影響。腸道菌群呈現(xiàn)動態(tài)發(fā)育過程，直至育肥期才趨于穩(wěn)定，故本研究測定育肥期30～100 kg 杜洛克FCR，探究此階段高低FCR 個體間的微生物多樣性差異對豬的生長性能的影響具有合理性。

本研究發(fā)現(xiàn)在門水平上，HFCR 組和LFCR 組中共鑒定到14 個門水平菌，其中，2 組中檢測到2 個優(yōu)勢菌門，分別為Fimicutes 和Bacteroidetes，這與之前的報道結(jié)果類似[11]；在屬水平，2 組共鑒定到114 個屬水平菌，其中Prevotella、norank_f_Ruminococcaceae、Lactobacillus是2 組中占據(jù)前三位的優(yōu)勢菌屬。Pajarillo等[12]對杜洛克進(jìn)行16S rRNA 高通量測序，發(fā)現(xiàn)普氏菌屬（Prevotella）一直是其優(yōu)勢菌屬，與本研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)普氏菌屬有利于降解黏蛋白和植物性碳水化合物（如半纖維素和木聚糖），這在飼料消化中具有重要的作用[12]。本研究的優(yōu)勢菌屬乳桿菌屬（Lactobacillus）多被認(rèn)為是益生菌。黃金秀等[14]研究發(fā)現(xiàn)，作為腸道內(nèi)優(yōu)勢的乳桿菌之一的羅伊氏乳桿菌，可以通過重塑豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響腸道黏膜免疫功能，調(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡。乳酸桿菌屬可在均質(zhì)發(fā)酵或異源發(fā)酵中將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸，或在異質(zhì)發(fā)酵中將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乙酸，這2 種酸產(chǎn)生的酸化環(huán)境可以抑制其他微生物的生長[15]，有利于維持胃腸道健康以及營養(yǎng)物質(zhì)吸收，對于豬的生長性能也具有一定意義，也在一定程度上說明了動物的腸道菌群可以影響宿主的生長性狀。

從本研究PCOA 的結(jié)果可以看出，在門和屬水平上微生物組成都沒有根據(jù)FCR 分為2 組，說明高低FCR杜洛克糞便微生物在菌群結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，但是兩組間仍表現(xiàn)出具體的差異性，這種差異性很大程度上是由于2 組個體在飼料利用率性狀上的差別造成的。

LEfSe 分析顯示，HFCR 組和LFCR 組中在微生物的門、綱、目、科、屬分類水平上共檢測到23 個差異項，可作為潛在的生物標(biāo)志物，其中g(shù)_unclassified_o_Bacteroidales等9 個在HFCR 組中富集，p_Actinobacteria等14 個菌群在LFCR 組中富集。前人報道，Actinobacteria與脂肪呈正相關(guān)，暗示著Actinobacteria的富集可能有利于脂肪的沉積[16]；Mccormack 等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，高飼料效率豬回腸中Actinobacteria豐度是低飼料利用效率豬豐度的3 倍，說明Actinobacteria可能是潛在標(biāo)志飼料利用率的菌群之一，同時也證明了糞便微生物組可在一定程度上代表腸道微生物組。屬水平進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LFCR 組中的差異項顯著多于HFCR 組且Collinsella、norank_f_Enterobacteriaceae、Staphylococcus、1-68、norank_o_Streptophyta在LFCR組中的豐度顯著高于HFCR 組，與相關(guān)的報道高低組的差異菌群不符[6]，這可能是由性別、年齡、品種、飲食、環(huán)境、采樣方式和保存方式等諸多因素引起的。本研究是由糞便微生物代替腸道微生物，結(jié)果不同也說明糞便微生物雖然可以在一定程度上代表腸道微生物，但仍有一定差異，雖然已有研究表明腸道微生物與豬的FCR有潛在的聯(lián)系，但相關(guān)菌群的功能并未研究的很透徹。此外，因為宿主本身FCR 不同導(dǎo)致腸道微生物組成的不同，還是因為微生物組成不同才導(dǎo)致FCR 不同，仍需進(jìn)一步深入研究。

功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)杜洛克高低FCR 組的腸道微生物組功能無顯著差異，但主要集中于氨基酸運輸和代謝、碳水化合物運輸和代謝。小腸中的非消化性碳水化合物包括纖維素、木聚糖和抗性淀粉，可以被腸道中的微生物發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸及其衍生物，從而為微生物和宿主生長提供所需的能量[17]，在育成豬配方日糧中主要成分包括富含纖維的玉米和高蛋白大豆，因此豬腸道微生物組的此種構(gòu)成可能具有更高的纖維素消化利用能力；而發(fā)酵膳食纖維在腸道菌群的作用下可產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），而SCFAs 可以減少腸道炎癥，從而提高腸道的吸收能力，并提高豬的FCR，推測以氨基酸運輸和代謝、碳水化合物運輸和代謝為主要功能的腸道菌群是環(huán)境和飼料等多重因素導(dǎo)致的，可能與FCR 有關(guān)系，其機(jī)理還需要更深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)高低FCR 組之間的糞便微生物組存在一定差異，支持了腸道微生物群的組成和潛在功能與FCR 相聯(lián)系的假說。但這些差異被認(rèn)為是微妙的，因為在所有檢測到的分類單元中，差異相對較小，并且大多數(shù)確實以較低的相對豐度（＜2%）出現(xiàn)。不過這些分類單元仍可能會影響FCR，腸道菌群內(nèi)部的復(fù)雜相互作用也可能會對宿主體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和FCR 產(chǎn)生最大影響，所以探索豬高、低FCR 腸道微生物的組成和差異，挖掘與FCR 相關(guān)的腸道菌群，進(jìn)而通過飲食干預(yù)豬腸道微生物的組成，提高豬的FCR 將是一種非常有潛力的策略和研究思路。

4 結(jié) 論

本研究采用16S rRNA 技術(shù)分析杜洛克公豬高、低FCR 組的腸道微生物，揭示了與FCR 相關(guān)的復(fù)雜細(xì)菌群落。在整個菌群結(jié)構(gòu)上，高低FCR 組的優(yōu)勢菌在類別上相同，僅在微生物的相對比例上有所差別。在高和低FCR 組中發(fā)現(xiàn)了與FCR 相關(guān)的潛在微生物標(biāo)記物。功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)杜洛克豬腸道微生物主要參與氨基酸運輸和代謝、碳水化合物運輸和代謝等營養(yǎng)代謝通路。本研究闡述了與豬飼料利用率相關(guān)的差異菌群，為進(jìn)一步研究杜洛克豬飼料利用率與腸道微生物群的關(guān)系提供了一定的理論基礎(chǔ)。