牦牛附睪ADAM28基因CDS區(qū)的克隆和表達(dá)研究

王紅梅，楊劉玥玲，吳逸韜，楊獻(xiàn)康，鄭旭昕，趙旺生

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010）

去整合素-金屬蛋白酶（Disintegrin and Metallopro teinase 28，ADAM28）基因家族成員具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，包括前域、金屬蛋白酶和崩解素域以及半胱氨酸域。ADAM 蛋白在細(xì)胞黏附與遷移、細(xì)胞融合、精子發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生等細(xì)胞活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。哺乳動(dòng)物附睪是精子獲得動(dòng)力和受精能力的關(guān)鍵部位，附睪管是一個(gè)高度有序和分節(jié)的器官，每一個(gè)片段都代表一個(gè)獨(dú)特的生理分區(qū)。每個(gè)小室在上皮細(xì)胞內(nèi)都有獨(dú)特的基因表達(dá)譜，導(dǎo)致特定的蛋白質(zhì)分泌到管腔液中，直接或間接影響精子成熟[1]。

ADAM28 是一種含有催化位點(diǎn)的金屬蛋白酶，已有數(shù)據(jù)表明在小鼠附睪中至少存在2 種ADAM28的剪接形式，其組織印記分析顯示ADAM28在小鼠附睪中以交替剪接的形式高表達(dá)[2]，提示其可能在精子成熟過程中發(fā)揮作用。Miyamae 等[3]在獼猴附睪和小鼠附睪的cDNA 文庫(kù)中測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ADAM28在獼猴附睪中表達(dá)高，在淋巴結(jié)、胰腺、卵巢和子宮中表達(dá)低；在小鼠附睪高表達(dá)，在肺、氣管、胃等組織低表達(dá)，因此在不同物種中，負(fù)責(zé)在生理?xiàng)l件下表達(dá)ADAM28的細(xì)胞類型是不同的。由于ADAM28在附睪的高水平表達(dá)及其能夠分泌CD200 從而參與免疫抑制[4-5]，推測(cè)ADAM28參與了精子的成熟和免疫抑制，但沒有直接證據(jù)證明這種可能性，因此有必要對(duì)ADAM28基因在牦牛附睪不同區(qū)域的表達(dá)進(jìn)行研究。本研究利用克隆手段獲得ADAM28基因的CDS 區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量檢測(cè)其在附睪組織中的表達(dá)，以期為探討高原動(dòng)物的生殖機(jī)制提供基本數(shù)據(jù)，同時(shí)為研究ADAM28基因在牦牛附睪上皮細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 四川省阿壩州紅原縣屠宰場(chǎng)采集3 頭成年且年齡相近、體格相似、身體健康的公牦牛的睪丸。Hanks 溶液漂洗3 次將附睪從睪丸中分離出來(lái)，分為附睪頭、附睪體、附睪尾，置于凍存管中迅速放入液氮中冷凍保存。利用PCR（qPCR）技術(shù)，以內(nèi)參基因UXT作為對(duì)照基因，以附睪頭作為對(duì)照組，附睪體和附睪尾部作為處理組，運(yùn)用2-△△Ct方法可計(jì)算出ADAM28基因在附睪組織頭、體、尾的相對(duì)表達(dá)量，觀察ADAM28基因在牦牛附睪組頭、體、尾3 個(gè)不同區(qū)段中的表達(dá)情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛附睪組織總RNA 的提取 按照Trizol 試劑說明書提取牦牛附睪組織3 個(gè)不同區(qū)段的總RNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 質(zhì)量，并保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及克隆 牦牛ADAM28基因全長(zhǎng)2 447 bp，包含20 個(gè)外顯子，其CDS 區(qū)有2 235 bp 編碼744 個(gè)氨基酸。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)牦牛ADAM28基因的PCR 克隆引物：ADAM28-F：5'-ATGGAGATCAATGTGGAC-3'，ADAM28-R：5'-TGGCAAACAATAGTAAGG-3'，以牦牛附睪組織逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用20.0 μL擴(kuò)增體系：DNA 聚合酶10.0 μL，雙蒸水7.0 μL，混勻的上下游特異性引物2.0 μL(10 μmol/L)，附睪頭、體、尾的cDNA 各加1.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 4 min；94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s；共循環(huán)40 次，后72℃延伸2 min。將產(chǎn)物電泳檢測(cè)后進(jìn)行DNA 的純化并與目的片段和載體連接，轉(zhuǎn)化及鑒定后送成都擎科梓熙生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 ADAM28 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 利用軟件BioXM 2.6 分析牦牛ADAM28 的核苷酸和氨基酸序列；利用在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析ADAM28 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用NCBI 的BLAST 功能比對(duì)氨基酸同源性，MEGA 6.0軟件對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行構(gòu)建，其他相關(guān)生物學(xué)的預(yù)測(cè)參考胡斐等文獻(xiàn)中介紹的方法[16]。

1.2.4 熒光定量PCR 利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)ADAM28基因及內(nèi)參基因UXT的特異性定量引物，ADAM28-F：5'-TTGCCTCTTTAATGTCCC-3'，ADAM28-R：5'-GCATTCTCCTAACGCACA -3'；UXT-F：5'-TGTGGCCCTTGGATATGGTT-3'，UXT-R：5'-GGT TGTCGCTGAGCTCTGTG-3。熒光定量操作方法按照生工生物工程（上海）股份有限公司的2×SG Fast qPCR Master Mix 試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系10.0 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），PCR-grade water 3.1 μL，模 板DNA為0.5 μL，ddH2O 0.6 μL，以每樣3 個(gè)重復(fù)為對(duì)照。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3 min，95℃ 2 s，60℃ 25 s；40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 牦牛ADAM28基因克隆產(chǎn)物 克隆結(jié)果顯示，所篩選的牦牛ADAM28載體經(jīng)過測(cè)序分析后可知產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為2 336 bp，其中包含牦牛ADAM28基因的CDS 序列2 235 bp，共編碼744 個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

2.2 牦牛ADAM28 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ADAM28 氨基酸分子式為C3643H5727N1005O1125S64，分子量為83.66 ku，總氨基酸數(shù)744，其中賴氨酸含量最高，占總氨基酸數(shù)的8.7%，其次為亮氨酸，占7.0%，第三為絲氨酸，占6.9%，色氨酸含量最低，占1.3%。其負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）和正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)分別是94和90，等電點(diǎn)為6.58，總親水系數(shù)（GRAVY）為-0.479，脂肪系數(shù)值為69.56。不穩(wěn)定性系數(shù)為36.12，蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定。

2.3ADAM28同源性 牦牛ADAM28核苷酸序列與綿羊（登錄號(hào)：XM_027964322.1）、山羊（登錄號(hào)：XM_005684210.3）、白尾鹿（登錄號(hào)：XM_020900956.1）、野豬（登錄號(hào)：XM_005670434.3）和鼠耳蝠（登錄號(hào)：XM_015569247.1）的同源性分別為96.27%、96.29%、95.18%、84.71%、83.03%（圖1），可知牦牛與山羊、綿羊親緣關(guān)系較近，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

圖1 ADAM28 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 牦牛ADAM28 蛋白的結(jié)構(gòu) 利用NeTPhos 3.1 Server 預(yù)測(cè)ADAM28 蛋白磷酸化位點(diǎn)顯示有絲氨酸31個(gè)、酪氨酸13 個(gè)、蘇氨酸22 個(gè)。利用ProtScale 分析其親疏水性（圖2），最大值3.622 在第694 個(gè)位點(diǎn)上，最小值-3.622 在第233 個(gè)位點(diǎn)上；ADAM28 整體為親水性蛋白，這與其理化性質(zhì)預(yù)測(cè)相符。由SOPMA 軟件分析ADAM28 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其蛋白質(zhì)序列由744個(gè)氨基酸組成，122 個(gè)處于α螺旋區(qū)，占16.40%；154個(gè)在延伸鏈結(jié)構(gòu)，占20.70%；40 個(gè)位于β轉(zhuǎn)角區(qū)，占5.38%；428 個(gè)處于無(wú)規(guī)則狀態(tài)，占57.53%；利用TMHMM 2.0 分析其跨膜區(qū)（圖3），牦牛ADAM28蛋白的676～698 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)。采用SignalP 4.1 Server 預(yù)測(cè)ADAM28 蛋白質(zhì)信號(hào)肽情況（圖4），結(jié)果顯示牦牛ADAM28 蛋白不存在信號(hào)肽序列，經(jīng)Softberry 預(yù)測(cè)，牦牛ADAM28 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

圖2 ADAM28 親疏水預(yù)測(cè)圖

圖3 牦牛附睪ADAM28 蛋白結(jié)構(gòu)域圖

圖4 牦牛附睪ADAM28 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.5 牦牛附睪不同區(qū)域的基因表達(dá) 如圖5 所示，ADAM28基因在附睪組織不同區(qū)段中的表達(dá)差異極大（P＜0.01），其中表達(dá)量最高的部位為頭部，附睪體部和尾部中表達(dá)量較低。

圖5 ADAM28 基因在牦牛附睪不同部位的相對(duì)表達(dá)情況

3 討 論

ADAMs（崩解素和金屬蛋白酶）是一個(gè)跨膜和分泌蛋白家族，通過對(duì)細(xì)胞黏附、遷移、蛋白水解和信號(hào)傳導(dǎo)作用在調(diào)節(jié)細(xì)胞表型中發(fā)揮重要作用[6]，同時(shí)是精子和卵子黏附融合所需要蛋白的決定基因，這些蛋白存在于精子膜上，在受精時(shí)起重要作用[7]。

ADAMs 與整合素相互作用的生理相關(guān)性在受精過程中得到了明確的證明，在豚鼠精子表面發(fā)現(xiàn)的ADAM-1 也稱作PH-30，在小鼠及猴子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的ADAM-2 也稱為受精-beta[10]，這2 種蛋白質(zhì)在成熟過程中都失去了它們的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，并直接暴露細(xì)胞表面的解體蛋白結(jié)構(gòu)域[11]，基于ADAM1-6在哺乳動(dòng)物男性生殖器官如睪丸和附睪中的表達(dá)[12]，其他的ADAMs也被認(rèn)為參與了卵-精膜融合受精過程。在ADAM家族中，ADAM1、ADAM-2和ADAM-3在調(diào)節(jié)受精過程中起關(guān)鍵作用，但并不依賴于其黏附和融合潛能[13]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏ADAM-1和ADAM-2的精子在遷移過程中都有缺陷，但細(xì)胞黏附和融合過程只有微小的改變，而ADAM-2 和ADAM-3 蛋白質(zhì)復(fù)合物對(duì)于精子從子宮到輸卵管的體內(nèi)遷移至關(guān)重要[14]。

本研究克隆獲得牦牛ADAM28序列長(zhǎng)2 247 bp，CDS 區(qū)有2 235 bp，氨基酸為744 個(gè)，ADAM28親緣距離是從偶蹄目到食肉目到嚙齒目，進(jìn)化樹演變同動(dòng)物分類學(xué)規(guī)律演變一致。其蛋白質(zhì)帶負(fù)電，且GRAVY 為負(fù)值，因此牦牛ADAM28 編碼的是帶負(fù)電的穩(wěn)定的親水性蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)該蛋白磷酸化位點(diǎn)有66 個(gè)，為研究其磷酸化提供了思路，同時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則狀態(tài)為主，并在其基礎(chǔ)上延伸，預(yù)測(cè)其跨膜域時(shí)，ADAM28 蛋白的第676～698 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)，但SignalP 4.1 預(yù)測(cè)其信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號(hào)肽的存在，其以亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。在牦牛整個(gè)附睪中均檢測(cè)到ADAM28但附睪頭組織中ADAM28水平遠(yuǎn)高于附睪體和附睪尾，與ADAM 家族其他成員不同，ADAM28 蛋白不具有典型的前蛋白轉(zhuǎn)化酶的裂解位點(diǎn)[2]，ADAM28 通過細(xì)胞表面表達(dá)的成熟跨膜蛋白對(duì)前結(jié)構(gòu)域的自催化去除而被激活，作為膜錨定蛋白，ADAM28 的自催化活性已得到驗(yàn)證[17]，ADAM28的表達(dá)與sCD200（與免疫抑制有關(guān)）顯著相關(guān)，已確定存在2 種ADAM28 的替代形式，即膜結(jié)合形式的ADAM28-m 和分泌形式的ADAM28-s，其中膜結(jié)合形式的ADAM28-m 在釋放CD200 過程中起重要作用，因此推測(cè)ADAM28在精子成熟和免疫抑制方面起重要作用[15]。

在男性不育癥患者的精液中檢測(cè)到多個(gè)ADAM基因缺失或不表達(dá)，而ADAM家族基因在生育過程中可能存在重要作用[7]，推測(cè)其在牦牛附睪體部和尾部的低表達(dá)可能在牦牛生殖生理過程中起重要作用，但ADAM28在雄性生殖過程中的機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆牦牛ADAM28基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ADAM28 蛋白為穩(wěn)定的帶負(fù)電蛋白，具有親水性，存在跨膜結(jié)構(gòu)域；經(jīng)過qPCR 技術(shù)檢測(cè)，ADAM28在牦牛附睪組織表達(dá)分布不均，附睪頭的表達(dá)顯著高于附睪頸和附睪尾。本研究初步對(duì)牦牛的ADAM28在牦牛附睪組織的不同表達(dá)進(jìn)行了探索，將為牦牛精子成熟的機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)資料，同時(shí)為進(jìn)一步研究ADAM28基因在牦牛附睪上皮細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。