超聲輔助提取蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)

武忠偉，張朝輝，冷豆豆，張 廣，宋琳琳，王 斌，孟 麗，邱立友

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)博士后流動(dòng)站，河南鄭州 450046；2.河南科技學(xué)院博士后研發(fā)基地，河南新鄉(xiāng) 453003；3.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003）

在多種食藥用真菌中，多糖組分由于具有抗氧化、免疫調(diào)劑、抗腫瘤、腸道菌群調(diào)節(jié)等作用，是生物資源開發(fā)的重要活性成分[1-3]。傳統(tǒng)的如香菇多糖、云芝糖肽、靈芝多糖、蟲草多糖、灰樹花多糖等均有報(bào)道顯示它們在體內(nèi)外具有多種優(yōu)良的生物活性，已成為多種功能性產(chǎn)品開發(fā)的重要來源[4-8]。蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali）是從天然蟲草生長后期分離出的一種重要內(nèi)生真菌，從其菌絲體和發(fā)酵液中可分離到多種生物活性物質(zhì)如腺苷類、皂甙類和多糖類[9-11]。研究表明，對于其所產(chǎn)生的多糖類成分，多項(xiàng)研究表明它在體內(nèi)抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤方面具有較好的作用效果[12-14]。2005年已被我國衛(wèi)生部列為可用于真菌類保健食品的開發(fā)名錄[15]。

由于菌絲多糖常以糖蛋白的形式結(jié)合于真菌細(xì)胞壁上，傳統(tǒng)采用高溫水煮的方法加以提取，常存在提取時(shí)間長、能耗高、提取率低等特點(diǎn)[16]。研究表明，常見真菌多糖如松茸多糖、靈芝多糖和蝙蝠蛾擬青霉多糖等在高溫水提時(shí)常需在90 ℃以上的高溫提取1～3 h，且有時(shí)還需要提取多次，除了提取率低、耗能多外，高溫長時(shí)間提取還會(huì)產(chǎn)生褐變反應(yīng)，造成后期多糖脫色困難[12,16-18]。超聲輔助提取法具有穿透力強(qiáng)、提取時(shí)間短、溶劑少等優(yōu)點(diǎn)，以廣泛應(yīng)用于多種生物物質(zhì)的提取過程中[19]。且有研究表明，超聲提取所獲得的生物活性多糖還具有較高溫水提條件下更加優(yōu)良的生物活性[6,20-22]。

為此，本研究分別采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖的超聲輔助提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用多種理化分析手段對該菌絲體多糖的化學(xué)組成和分子量分布進(jìn)行了測定，以期為該菌絲體多糖的開發(fā)利用提供技術(shù)參數(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝙蝠蛾擬青霉菌絲體 為P.hepialiHN-1菌株經(jīng)液體發(fā)酵后將發(fā)酵醪過濾洗滌、干燥粉碎后的菌絲體干粉，具體制備方法見1.2.1；牛血清白蛋白、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、葡糖糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、重蒸酚、考馬斯亮藍(lán)、間羥聯(lián)苯、鉬酸銨、溴化鉀 分析純，美國Sigma公司；甲醇、乙腈 色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ZWY-2102恒溫振蕩器、ZXSD-A1160生化培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；FB224電子分析天平 上海舜字恒平科學(xué)儀器有限公司；GWS100型10 L機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司；L550型臺式離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；ZN04小型中藥粉碎機(jī) 北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；SB-500DYT超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司；Agilent1100高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器、Instrument 化學(xué)工作站） 美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體干粉的制備 按參考文獻(xiàn)[23]中所述方法進(jìn)行培養(yǎng)，然后將所收獲發(fā)酵醪用400目濾網(wǎng)過濾后，蒸餾水反復(fù)洗滌3次，分散于篩網(wǎng)上于70 ℃下烘干，后用85%的乙醇回流脫脂12 h后70 ℃下再次干燥，干燥后的菌絲體用中藥粉碎機(jī)粉碎成干粉并過100目篩，備用。

1.2.2 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖（PHMPs）的超聲輔助提取 精確稱取5.000 g 上述蝙蝠蛾擬青霉菌絲體干粉放入三角瓶中，按不同液料比加入蒸餾水，在不同超聲條件下提取多糖類物質(zhì)，提取液于25℃條件下4000 r/min離心10 min后，加3倍無水乙醇于4 ℃條件下沉淀過夜，沉淀用80%的乙醇溶液反復(fù)洗滌3次后，加蒸餾水復(fù)溶。

1.2.3 多糖含量的測定及提取得率的計(jì)算 復(fù)溶后溶液中的多糖含量采用苯酚硫酸法[24]測定，具體先采用無水葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到含糖量質(zhì)量濃度ρ（mg/L）與吸光度A 的回歸方程：ρ=0.0086A+0.0097（R2=0.9994），用同樣的方法測定樣品中多糖含量。

PHMPs得率（%）按式（1）計(jì)算：

式中：C為提取液中多糖的含量（mg/L）；V為提取液的體積（L）；W0為樣品干粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以多糖得率為指標(biāo)，在液料比30 mL/g，提取功率250 W，提取時(shí)間30 min，提取溫度80 ℃為基礎(chǔ)條件下，分別試驗(yàn)提取溫度（X1，50、60、70、80、90 ℃）， 提取時(shí)間（X2， 20、30、40、50、60 min），液料比（X3，20、30、40、50、60 mL/g）和超聲功率（X4，200、250、300、350、400 W）對超聲輔助提取PHMPs得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化PHMPs的提取條件，具體因素和水平見表1。

表1 PHMPs提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for PHMPs extraction

1.2.6 菌絲體多糖理化特征的測定 將1.2.2中所述的PHMPs多糖溶液真空冷凍干燥后，可得到PHMPs多糖干粉。對于該多糖干粉中的糖含量采用苯酚硫酸法測定[24]；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[25]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得蛋白質(zhì)量濃度ρ（mg/L）與吸光度A 的回歸方程：ρ=0.0043A+0.0639（R2=0.9965）；糖醛酸含量采用間羥聯(lián)苯法測定[26]，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，可得糖醛酸含量濃度ρ（mg/L）與吸光度A的回歸方程ρ=0.0645A+0.0269（R2=0.9971）；磷酸基含量采用鉬酸銨-分光光度法測定[27]，以KH2PO4為標(biāo)準(zhǔn)品，可得磷酸基含量濃度ρ（mg/L）與吸光度A的回歸方程ρ=0.01A+0.0049（R2=0.9994）。

1.2.7 菌絲體多糖的紅外光譜分析 采用KBr壓片法測定PHMPs多糖樣品的紅外吸收光譜，具體操作為：取干燥后的KBr粉末100 mg左右在瑪瑙研缽中研磨均勻后，用壓片機(jī)壓成薄片，然后置于傅立葉變換紅外光譜儀上在4000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行背景掃描，然后將1 mg左右的PHMPs多糖樣品于KBr粉末混勻后采用同樣操作進(jìn)行樣品掃描。

1.2.8 菌絲體多糖分子量測定 采用高效液相凝膠滲透色譜法對不同組分多糖進(jìn)行均一性和分子量測定，具體色譜條件為：色譜柱TSK-GEL G3000SWxlcolumn （7.8 mm×300 mm，5 μm）；示差折光檢測器（RID）；流動(dòng)相：0.1 mol/L的Na2SO4的磷酸緩沖液溶液（0.01 mol/L，pH6.8）；流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。以普魯蘭多糖P-800、P-400、P-200、P-100、P-20、P-10和 P-5作為標(biāo)準(zhǔn)品,以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量對數(shù)值Y為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間t為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=-2.4046 t+22.29，R2=0.9964）。

1.2.9 菌絲體多糖的單糖分析 采用PMP柱前衍生化法測定多糖的單糖組成[28]。具體方法為先稱量5 mg多糖樣品配制成5 mg/L的多糖溶液，取100 μL加入具塞玻璃管中，再加入4 mol/L三氟乙酸100 μL封管，在110 ℃下水解2 h，冷卻后重復(fù)加入200 μL甲醇于50 ℃下減壓蒸干3次后，加100 μL去離子水溶解后；取溶解后的水解樣品50 μL加入0.6 mol/L的NaOH溶液50 μL混合均勻后加入100 μL的PMP甲醇溶液混合均勻，于70 ℃下反應(yīng)100 ℃，冷卻后加入0.3 mol/L HCl 溶液中和反應(yīng)并于50 ℃下減壓蒸干后，加入1 mL蒸餾水溶解，后用氯仿反復(fù)萃取，萃取后的水相用0.45 μL的濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

色譜條件：RP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.7）:乙腈為83:17（V:V）的混合液，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，樣品量20 μL，檢測波長245 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件繪圖，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同提取溫度對菌絲多糖得率的影響 在超聲功率250 W、超聲時(shí)間30 min、液料比30 mL/g的條件下，分別比較了不同提取溫度50、60、70、80和90 ℃條件下對PHMPs得率的影響，結(jié)果見圖1。PHMPs的得率隨著提取溫度從50 ℃增加至80 ℃不斷增加。溫度對多糖得率的促進(jìn)作用可能是由于在高溫條件下可以降低提取液的粘度和密度，從而促進(jìn)多糖組分的溶出量[29]。另外，在高溫條件下超聲波的空穴效應(yīng)及固液接觸面積增加也可進(jìn)一步增加多糖的提取效率[30]。此時(shí)，菌絲體多糖的得率為10.27%±0.28%。因此，進(jìn)一步對溫度的優(yōu)化范圍可選擇在70～90 ℃之間。

圖1 提取溫度對PHMPs得率的影響Fig.1 Effect of different extraction temperature on the yield of PHMPs

2.1.2 不同提取時(shí)間對菌絲體多糖得率的影響 在超聲功率250 W、超聲溫度80 min、液料比30 mL/g的條件下，分別比較了不同提取時(shí)間20、30、40、50和60 min條件下對PHMPs得率的影響，結(jié)果見圖2。隨著提取時(shí)間增加至30 min后，多糖得率不再顯著增加，且隨著提取時(shí)間的延長，多糖得率還會(huì)出現(xiàn)減少趨勢。這可能是由于超聲條件下過長的提取時(shí)間會(huì)造成部分多糖水解從而降低多糖的得率[30]。因此選擇超聲時(shí)間為20～40 min的范圍作為優(yōu)化區(qū)間為宜。

圖2 提取時(shí)間對PHMPs得率的影響Fig.2 Effect of the different extraction time on the the yield of PHMPs

2.1.3 不同液料比對菌絲體多糖得率的影響 在超聲功率250 W、超聲溫度80 min、提取時(shí)間30 min的條件下，分別比較了不同液料比20、30、40、50和60 mL/g條件下對PHMPs得率的影響，結(jié)果見圖3。隨著液料比不斷增加，PHMPs的得率呈現(xiàn)逐步上升趨勢，但當(dāng)液料比增加至40 mL/g，則多糖的得率不再顯著增加。因此，考慮提取溶劑和后期分離的節(jié)約性原則，初步選擇30～50 mL/g作為進(jìn)一步優(yōu)化的取值區(qū)間。

圖3 液料比對PHMPs得率的影響Fig.3 Effect of different ratio of water to material on the yield of PHMPs

2.1.4 不同超聲功率對菌絲多糖得率的影響 在液料比40 mL/g、超聲溫度80 min、提取時(shí)間30 min的條件下，分別比較了不同功率200、250、300、350和400 W條件下對PHMPs得率的影響，超聲功率對菌絲體多糖得率的影響如圖4所示。隨著超聲功率由200 W逐步增加至300 W，PHMPs的得率呈顯著增加趨勢（P＜0.05），但隨著超聲功率的進(jìn)一步增加，多糖的得率則有下降趨勢。這可能是因?yàn)樵诘统暪β蕳l件下，產(chǎn)生的細(xì)胞破碎效應(yīng)可以提高多糖的溶出效果，但過高的超聲功率則可能會(huì)造成PHMPs多糖的降解[31]。因此，進(jìn)一步選擇250～350 W作為進(jìn)一步超聲提取優(yōu)化的取值區(qū)間。

圖4 超聲功率對PHMPs得率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power on the yield of PHMPs

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

綜合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken原理，以PHMPs得率（Y）為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化提取條件。選取影響PHMPs得率的4個(gè)主要因素提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）和超聲功率（X4）為自變量，采用四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸擬合，可以得到如下二次多元回歸方程：

Y=-165.239+2.709X1+0.810X2+0.453X3+0.291X4-4.375E-003X1X2+1.450E-003X1X3-9.900E-004X1X4+5.150E-003X2X3-1.175E-003X2X4+3.300E-004X3X4-0.014X12-4.63667E-003X22-9.587E-003X32-3.070E-004X42

對上述實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。可以看出，模型F值為6.82，P值為0.0005，表明該回歸模型顯著。失擬項(xiàng)的P值為0.1487，相對于純誤差不顯著，表明該模型中各變量的變化范圍可以用于預(yù)測菌絲體多糖產(chǎn)量。因素中X1、X2和X3的一次項(xiàng)和X12、X32和X42的二次項(xiàng)系數(shù)顯著（P＜0.05），但 X4，X22和交互項(xiàng)系數(shù)均不顯著（P＞0.05）。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化

進(jìn)一步通過繪制響應(yīng)面圖以直觀觀察不同提取因素對提取得率的影響，結(jié)果如圖5所示。X1X2、X2X4、X1X4也即提取溫度和提取時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間以及提取溫度和提取時(shí)間之間的等高線圖均成橢圓形，表明他們之間均有較強(qiáng)的交互作用。雖然二次方程系數(shù)方差分析不顯著，這可能是由于因素設(shè)計(jì)時(shí)步長選擇較小的原因。進(jìn)一步通過軟件優(yōu)化可以得出最優(yōu)的提取參數(shù)為：提取溫度81 ℃，提取時(shí)間36 min，超聲功率297 W、液料比44 mL/g。在此條件下，通過了5次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，其菌絲體多糖的平均得率為13.10%±0.22%，與預(yù)測值12.61%差異不顯著（P＞0.05），表明該回歸方程可較好的預(yù)測菌絲體多糖提取得率。

表2 菌絲體多糖得率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and response values for ultrasonic extraction yields of PHMPs

2.4 菌絲多糖理化成分分析

理化成分分析如表4所示，所提取的蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖中中性糖含量在78.48%±2.08%，另外還含有9.82%±0.09%的蛋白成分。除此之外，該菌絲體多糖中還含有3.76%±0.11%的糖醛酸及2.23%±0.09%的磷酸基成分。

2.5 菌絲體多糖的紅外掃描分析

由PHMPs的紅外光譜圖6可以看出，3392 cm-1處寬而強(qiáng)的吸收峰可歸屬為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，而2937 cm-1處的吸收峰是為烷基C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，它們均為糖類物質(zhì)的特征基團(tuán)[32]。1654和1419 cm-1處的強(qiáng)吸收峰可歸屬為C=O的非對稱伸縮和對稱伸縮振動(dòng)，表明該多糖中含有羧基基團(tuán)[33]。1059 cm-1區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)的一組強(qiáng)吸收峰可歸屬為吡喃糖環(huán)上C-O-C的伸縮振動(dòng)和C-O-H的變角振動(dòng)[34]。910和760 cm-1處的吸收峰可作為D-吡喃糖的特征信號，816和880 cm-1處的吸收峰表明可能同時(shí)存在α和β兩種構(gòu)型的吡喃糖存在[35]。

2.6 分子量分布的測定結(jié)果

采用高效液相凝膠色譜法對菌絲體多糖的分子量分布進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖7所示。經(jīng)超聲提取后蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖的分子量分布主要由保留時(shí)間7.74和7.85 min的兩個(gè)主峰及保留時(shí)間10.58～13.05 min的分子量呈連續(xù)分布的多糖組成。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出兩個(gè)主峰的多糖分子量在638和575 kDa，另外還存在分子量在5.6～285 kDa范圍呈連續(xù)分布的多糖組分。與報(bào)道文獻(xiàn)[32]傳統(tǒng)熱水提取法相比，該多糖的分子量較水提法有一定降低，小分子量多糖比例有一定程度增加，這可能是由于超聲提取過程中，對多糖有一定的降解作用造成的[36]。

表3 響應(yīng)面結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic model for D-value

圖5 不同超聲提取因素對菌絲體多糖得率的相應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of variables and their mutual effects on the extraction yield of PHMPs

表4 菌絲體多糖的理化成分分析Table 4 Physicochemical components analysis of PHMPs

圖6 PHMPs的紅外光譜圖Fig.6 FI-IR spectra of PHMPs

圖7 PHMPs多糖的高效凝膠色譜圖Fig.7 High-performance gel permeation chromatography showing the molecular weight distributions of PHMPs

2.7 菌絲體多糖的單糖組成分析

采用PMP-衍生化法測定了PHMPs多糖中的單糖組成，結(jié)果如圖8所示。與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜對照，可發(fā)現(xiàn)PHMPs中主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，它們的分子摩爾比在42.32:27.58:21.14，另外還含有少量核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸及阿拉伯糖，它們所占的分子摩爾比在0.42:2.89:2.25:1.16:2.24。該單糖組成與文獻(xiàn)[37]所報(bào)道的單糖種類相似，但單糖比例有較大差異，這可能與菌株的培養(yǎng)條件和所用培養(yǎng)基不同有關(guān)。除此之外，可以發(fā)現(xiàn)PHMPs中的單糖組成與天然蟲草多糖的單糖組成也較為接近[38]。

圖8 PMP衍生化法測定標(biāo)準(zhǔn)品中的單糖組成（A）和PHMPs中的單糖組成（B）Fig.8 HPLC chromatograms of PMP derivatives of standard monosaccharides (A) and component monosaccharides released from PHMPs (B).

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溫度、提取時(shí)間、提取功率和液料比對蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖的提取效果，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化確定出了蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌絲體多糖的最佳的超聲提取參數(shù)為：提取溫度81 ℃, 提取時(shí)間36 min， 超聲功率為297 W，水料比為44 mL/g。在此條件下，菌絲體多糖的提取得率為13.10%±0.22%。

理化分析表明，菌絲體多糖中除含有78.48%±2.08%的糖組分外，還含有9.82%±0.09%的蛋白成分及3.76%±0.11%、2.23%±0.09%的糖醛酸和磷酸基成分；紅外光譜分析表明，該多糖具有多種糖類官能團(tuán)的吸收特征，分子量分布顯示該多糖由分子量為638和575 kDa的兩個(gè)主峰和部分5.6～285 kDa小分子量多糖組成；單糖組成分析表明，PHMPs主要由分子摩爾比為42.32:27.58:21.14的甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，另外還含有少量分子摩爾比為0.42:2.89:2.25:1.16:2.24的核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸及阿拉伯糖。