毒死蜱降解菌株的分離鑒定及降解條件優(yōu)化

孫建波，張洪宇，龔忠闊，張 超，劉芝言，王紅蕾

（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012）

目前食用農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留污染極為嚴重，Barron等[1]分析了塔吉克斯坦四個農(nóng)村生食樣品中農(nóng)藥殘留，在肉類、乳制品和食用植物中檢出農(nóng)藥高殘留。2013年對波蘭谷物中農(nóng)藥殘留的檢測發(fā)現(xiàn)，波蘭北區(qū)谷物中農(nóng)藥殘留普遍存在[2]。Guo等[3]從浙江省的竹筍中檢測出三種類型的有機氯農(nóng)藥雙對氯苯基三氯乙烷（DDT）、六氯環(huán)己烷（HCH）和五氯硝基苯（PCNB）。Houbraken等[4]研究表明，農(nóng)藥的使用不僅導致農(nóng)作物中農(nóng)藥積累，在植物表面未被利用的農(nóng)藥同時可在昆蟲體內(nèi)積累，人類食用此類昆蟲同樣會對健康造成危害。

毒死蜱是一種廣譜有機磷類殺蟲劑[5]，作為高毒有機磷農(nóng)藥的替代品，具有高效低毒的特點，但是其缺點是在自然環(huán)境中半衰期較長[6]。目前，傳統(tǒng)的處理毒死蜱污染的方法有物理化學法和生物降解法，物理化學法包括紫外光解[7]、化學氧化法[8]、多相光催化降解[9]及輻射降解[10]，而生物降解是利用微生物及其復合菌群，通過自身代謝將毒死蜱作為能源降解成為無毒物質(zhì)[11]。目前已經(jīng)分離出來的毒死蜱降菌株包括腸桿菌屬[12]、產(chǎn)堿桿菌屬[13]、副球菌屬[14]、芽孢桿菌屬[15、木霉屬[16]及黑曲霉屬[17]。研究表明，不同降解菌具有不同的生物活性和代謝活性，在不同程度上受到溫度、pH、底物濃度、接種量等條件的影響[18-21]，為了菌株能夠應用到實際生活中，對菌株降解條件的優(yōu)化必不可少。

本文運用富集馴化的方法分離可高效降解有機磷類農(nóng)藥毒死蜱的降解菌株，對菌株降解酶的定位，降解廣譜性研究，運用正交試驗對降解菌的降解條件進行優(yōu)化，提高菌株的降解效率，有助于今后生物菌劑的制備，對農(nóng)藥污染環(huán)境修復及去除食用農(nóng)作物表面有機磷農(nóng)藥殘留方面極具應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 取自長白山區(qū)周邊農(nóng)田土壤，土樣放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；毒死蜱乳油（純?0%）、敵敵畏乳油（純度77.5%）、甲基對硫磷乳油（純度50%）、氧化樂果乳油（純度40%）、水胺硫磷乳油（純度40%）、乙草胺乳油（純度50%）、莠去津懸浮劑（純度38%） 當?shù)剞r(nóng)藥市場；毒死蜱標品純度99.1%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司；LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，固體培養(yǎng)基添加瓊脂18～20；MSM培養(yǎng)基（g/L）：NH4NO31.0，MgSO4·7H2O 0.5，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.5，NaCl 0.5，K2HPO41.5。

IS-RSD3臺式恒溫振蕩器 美國精騏有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠；T960PCR儀

力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SPX-70BⅢ生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DYY-6D型電泳儀 北京市六一儀器廠；BioDoc-It凝膠成像系統(tǒng) UVP公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 毒死蜱降解菌的富集與分離 無菌條件下稱取5 g土壤樣品，放入含有50 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min下，培養(yǎng)7 d，隨后以5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，逐步提高毒死蜱濃度分別為200、400、600、800 mg/L，取1 mL培養(yǎng)液，進行稀釋平板涂布，選取單菌落進行劃線分離純培養(yǎng)。

1.2.2 毒死蜱降解菌株的鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株AY-1進行菌落形態(tài)觀察和生理生化實驗。

利用試劑盒提取降解菌株基因組DNA，采用細菌16S rRNA基因通用引物27f和1492r對降解菌株的16S rRNA基因序列進行PCR擴增。PCR反應體系：10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture 4 μL，引物各1 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，加滅菌水至50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將所得測序結(jié)果在NCBI上進行比對，下載同源序列，利用MEGA5.0構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 細菌生長曲線的測定 將保存于試管斜面中的細菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，作為種子液。將種子液以1%的接種量，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測定菌株OD600，以OD600為縱坐標，時間為橫坐標繪制菌株的生長曲線

1.2.4 毒死蜱含量測定 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，37 ℃180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，乳油加入水中后，會形成均一的溶液[22]，為保證取出樣品的均勻性，因此在培養(yǎng)結(jié)束后，取5 mL含毒死蜱的培養(yǎng)基，加入等體積的石油醚漩渦振蕩1 min，靜置分層，取上清液用于檢測[23-24]。毒死蜱于λ=293 nm左右有特征吸收峰，通過紫外分光光度計測定樣品的OD293，計算樣品中毒死蜱的濃度，降解效率的計算公式為：

式中，x為毒死蜱降解效率；CA為對照樣品中毒死蜱的濃度；CX為處理樣品中毒死蜱的濃度。

1.2.5 毒死蜱標準曲線的測定 稱取一定量的毒死蜱標準品，用石油醚作為溶劑配制成濃度為500 mg/L儲備液，逐級稀釋配制濃度為1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L的工作液，測定工作液在OD293下的吸光度值，制作標準曲線。在無機鹽液體培養(yǎng)基及無機鹽液體培養(yǎng)基接種2%種子液當中添加毒死蜱添加濃度為 5、50和100 mg/L三個濃度，每個濃度重復三次，同時做空白對照。測定毒死蜱在樣品里的不同濃度添加回收率和變異系數(shù)。

1.2.6 菌株降解酶的定位 將180 r/min，37 ℃培養(yǎng)18 h的培養(yǎng)液以8000 r/min離心10 min，收集上清液，向上清液中加入適量（NH4）2SO4至飽和度為100%，4 ℃鹽析過夜，離心收集沉淀，用pH7.0、濃度0.05 mol/L的磷酸緩沖液溶解沉淀后再用同一緩沖液透析至無NH4+，得到胞外粗酶液。

將上述離心收集的菌體，以1:3（菌體:緩沖液）的比例懸浮于緩沖液中，置于冰浴中，以超聲波破碎儀破碎15次，將處理后的菌體以8000 r/min離心10 min，上清液即為胞內(nèi)粗酶液，將上述兩種粗酶液各取1 mL加入50 mL含有100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h，并設對照組，測定胞內(nèi)粗酶液和胞外粗酶液對毒死蜱的降解情況，以確定毒死蜱降解酶的位置。

1.2.7 碳源和氮源對Pseudomonas aeruginosaAY-1培養(yǎng)條件的影響

1.2.7.1 碳源對Pseudomonas aeruginosaAY-1培養(yǎng)條件的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以濃度為0.5%的不同碳源（蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘油、乙酸鈉、甘露醇）培養(yǎng)18 h，測定OD600數(shù)值。

1.2.7.2 氮源對Pseudomonas aeruginosaAY-1培養(yǎng)條件的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以濃度為0.1%的不同氮源（硝酸鈉、脲、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鎂）培養(yǎng)18 h，測定OD600數(shù)值。

1.2.8Pseudomonas aeruginosaAY-1降解條件的優(yōu)化

1.2.8.1 溫度對降解菌降解毒死蜱的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，毒死蜱濃度為100mg/L，在溫度值為25、30、35、40、45 ℃，以2%接種量接種于培養(yǎng)基中，以不加菌作為對照組，pH7、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，測定毒死蜱降解效率。

1.2.8.2 pH對降解菌降解毒死蜱的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，毒死蜱濃度為100 mg/L，在pH為5、6、7、8、9，以2%接種量接種于培養(yǎng)基中，以不加菌作為對照組，35 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，測定毒死蜱降解效率。

1.2.8.3 毒死蜱濃度對降解菌降解毒死蜱的影響挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在毒死蜱濃度為50、100、150、200、250 mg/L，以2%接種量接種于培養(yǎng)基中，以不加菌作為對照組，35 ℃、pH7、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，測定毒死蜱降解效率。

1.2.8.4 正交試驗設計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，當溫度在30～40 ℃，pH在6～8，底物濃度在100～200 mg/L范圍時降解效果相對明顯。因此選擇30、35、40共3個溫度水平，6、7、8共3個pH水平，100、150、200共3個底物濃度水平。采用L9（34）正交試驗方案，表1為三因素三水平正交設計，

表1 降解條件優(yōu)化正交試驗設計Table 1 Optimization of orthogonal test design for degradation conditions

1.2.9 菌株降解底物廣譜性研究 將菌株AY-1接種于含有500 mg/L敵敵畏、甲基對硫磷、氧化樂果、水胺硫磷、乙草胺和莠去津的MSM固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復三次，數(shù)據(jù)之間的顯著性差異用Duncan檢驗。采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及誤差分析。使用SPSS進行顯著性分析，使用Oringin9進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離鑒定

利用含有800 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基篩選出1株毒死蜱降解菌，將其命名為AY-1。由圖1可知，菌株AY-1在LB固體培養(yǎng)基，呈現(xiàn)濕潤、粘稠、不易挑起、質(zhì)地均勻。通過掃描電鏡觀察，菌株AY-1呈球桿狀。

菌株AY-1通過16S rRNA序列PCR擴增和測序，并與Blast數(shù)據(jù)庫進行相似度比較，同時調(diào)取菌株相似性最高模式菌株序列，利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹如圖2所示，該菌株歸屬于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

2.2 毒死蜱標準曲線

以毒死蜱濃度為橫坐標，OD293為縱坐標，得標準曲線如圖3所示，回歸方程為y=59.208x-0.065，R2=0.9992，表明毒死蜱標品在0～100 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，毒死蜱的濃度分別設置為 5、50和100 mg/L分別吸取一定體積的培養(yǎng)液，用1.2.1的方法進行提取，每一濃度分別測定三次。由表2可見，不加菌的培養(yǎng)基3個濃度毒死蜱的平均添加回收率在95.84%～102.75%之間，變異系數(shù)在2.29%～3.47%之間。加菌的培養(yǎng)基3個濃度毒死蜱的平均添加回收率在95.80%～102.08%之間，變異系數(shù)在1.80%～2.27%之間。表明分析方法滿足菌株降解農(nóng)藥殘留分析的要求。

圖1 菌株AY-1菌落和菌體形態(tài)Fig.1 Colony and morphology of strain AY-1

圖2 菌株AY-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain AY-1

圖3 毒死蜱標準曲線Fig.3 Chlorpyrifos standard curve

2.3 菌株P(guān)seudomonas aeruginosa AY-1的生長曲線

圖4 為菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1的生長曲線，0～2 h時，菌株生長較為緩慢，處于生長緩慢期，2 h后，OD600數(shù)值迅速增加，菌株進入對數(shù)生長期，代謝活動更為活躍，26 h后生長速度下降，增長較為緩慢。菌株的生長曲線為后期微生物菌劑的制備提供條件。

2.4 降解菌毒死蜱降解酶的定位

分別測定了胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液對毒死蜱的降解效率，以此來確定毒死蜱降解酶的位置，以緩沖液為空白對照，實驗結(jié)果如表3所示。由表3可知，胞內(nèi)粗酶液對毒死蜱的降解效率遠高于胞外粗酶液，胞外粗酶液對于毒死蜱微弱的降解效率可能是由于菌體釋放部分降解物質(zhì)，由此可知菌株AY-1產(chǎn)生的毒死蜱降解酶屬于胞內(nèi)酶。

表2 毒死蜱在培養(yǎng)基中的加標回收率Table 2 Recovery rate of chlorpyrifos in the culture medium

圖4 菌株AY-1生長曲線Fig.4 Growth curve of strain AY-1

表3 細菌不同位置的降解酶對毒死蜱的降解效率Table 3 Degradation efficiency of chlorpyrifos by degrading enzymes at different positions of bacteria

2.5 碳源和氮源對菌株P(guān)seudomonas aeruginosa AY-1培養(yǎng)條件的影響

2.5.1 碳源對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1生長的影響 如圖5所示，不同碳源對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1的生長影響程度不同，葡萄糖為最適碳源，其次為甘油，對蔗糖和麥芽糖的利用率較低。推測可能是不同碳源之間轉(zhuǎn)運及分解代謝方式的不同影響了菌株對碳源的利用，進而影響菌株生長[25]。

圖5 不同碳源對菌株AY-1生長的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth of strain AY-1

2.5.2 氮源對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1生長的影響 如圖6所示，不同氮源對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1的生長影響程度不同，硫酸銨為最適氮源，其次為脲素?？赡茉蚴羌毦貌煌葱枰煌拿?，對酶的活性有一定要求，因此菌株在不同氮源的條件下生長效果不同[26]。

2.6 菌株P(guān)seudomonas aeruginosa AY-1降解特性

2.6.1 溫度對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響 溫度對AY-1降解毒死蜱的影響如圖7所示，在不同的培養(yǎng)溫度下，菌株AY-1對毒死蜱的降解效率先升高后降低。從毒死蜱隨溫度升高的降解曲線可以看出，該菌對毒死蜱降解的最適溫度范圍為30～35 ℃。其中，當溫度為45 ℃時降解效率降到10%以下（P＜0.05），說明低溫和高溫對菌株降解毒死蜱都不利。這可能是因為微生物的生長需要一定的環(huán)境溫度條件。溫度相對較低時，隨著溫度提升，微生物及其酶活性提高，降解效率也隨之增大；超過微生物最適溫度后，溫度的升高會導致微生物活性下降，甚至死亡[27]。35 ℃時，菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1對150 mg/L毒死蜱降解效率達到最大為68.3%。

圖6 不同氮源對菌株AY-1生長的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the growth of strain AY-1

圖7 溫度對Pseudomonas aeruginosa AY-1降解毒死蜱的影響Fig.7 Effect of temperature on degradation of chlorpyrifos by Pseudomonas aeruginosa AY-1

2.6.2 pH對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響 pH對Pseudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響如圖8所示，初始pH在5～9范圍內(nèi)，AY-1對毒死蜱的降解效率先升高后降低，培養(yǎng)72 h后，pH=7時，菌株AY-1對150 mg/L毒死蜱降解效率達到最大為65%，當pH=9時，降解效率迅速降低。pH=7～8時，Pseudomonas aeruginosaAY-1對毒死蜱有較高的效率，兩者無顯著差異（P＞0.05），可能原因為培養(yǎng)體系pH的不同，會改變營養(yǎng)物質(zhì)的生物可利用性和污染物的形態(tài)及生物毒性，從而影響微生物的活性，最終導致微生物生長速率和污染物降解速率的變化[28]。

2.6.3 底物濃度對菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響 微生物對污染物的降解能力受到底物濃度的影響，特別是當?shù)孜餄舛冗^高時，會抑制微生物降解酶的產(chǎn)生，從而影響微生物的降解能力，底物濃度過低時，由于營養(yǎng)物質(zhì)不充足，導致降解效率較低[29]。底物濃度對Pseudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響如圖9所示，隨著底物濃度的增高降解效率隨之增高，當?shù)孜餄舛葹?50 mg/L時，降解效率達到最高為56.77%（P＜0.05）。底物濃度超過150 mg/L時，降解效率隨之降低，這說明底物濃度過高會抑制Pseudomonas aeruginosaAY-1對毒死蜱的降解。底物濃度低于150 mg/L時，隨著底物濃度增加，降解效率隨之增加。

圖8 pH對Pseudomonas aeruginosa AY-1降解毒死蜱的影響Fig.8 Effect of pH on degradation of chlorpyrifos by Pseudomonas aeruginosa AY-1

圖9 底物濃度對Pseudomonas aeruginosa AY-1降解毒死蜱的影響Fig.9 Effect of Substrate concentration on degradation of chlorpyrifos by Pseudomonas aeruginosa AY-1

2.6.4 多因素正交試驗 正交試驗結(jié)果由表4可知，通過正交試驗的極差R得出A、B、C 3因素對毒死蜱降解影響的大小順序為：B＞A＞C。這說明在菌株AY-1降解毒死蜱的過程中，pH對降解效率的影響最大，其次是溫度，底物濃度的影響最小，培養(yǎng)條件對毒死蜱降解的影響最優(yōu)組合為A2B3C1，即培養(yǎng)溫度為35 ℃，pH=8，底物濃度為100 mg/L時達到最佳降解狀態(tài)，降解效率為75.09%。

菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1經(jīng)過3 d可將100 mg/L的毒死蜱降解75.09%，相對于Shi等[30]篩選的Ochrobactrumsp.經(jīng)過7 d將100 mg/L毒死蜱降解75.18%，菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1用時更短，因此具有更好的應用價值。本文從現(xiàn)有文獻中得知，從環(huán)境中分離出了多種能夠降解毒死蜱的微生物如表5。由下表可知，Pseudomonas aeruginosaAY-1是降解毒死蜱效率最高的。

2.7 菌株降解底物廣譜性研究

菌株AY-1在500 mg/L的敵敵畏、氧化樂果、甲基對硫磷、水胺硫磷、乙草胺和莠去津固體平板上均能生長，如圖10所示，說明菌株AY-1對農(nóng)藥具有一定廣譜降解效果。敵敵畏、氧化樂果和水胺硫磷平板生長情況良好，而在甲基對硫磷、乙草胺和莠去津平板上生長較差，說明菌株AY-1對敵敵畏、氧化樂果和水胺硫磷降解潛力更大，對甲基對硫磷、乙草胺和莠去津降解潛力較低。

表4 降解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 4 Degradation conditions optimization orthogonal test results

表5 其他毒死蜱降解微生物降解效率Table 5 Degradation efficiency of other chlorpyrifosdegrading microorganisms

3 結(jié)論

本研究從長白山區(qū)農(nóng)田土中分離出一株降解毒死蜱菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1，通過形態(tài)學觀察，生理生化鑒定和16S rRNA測序，將其鑒定為銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌具有抗逆性強的特點，因此在生物修復污染環(huán)境方面具有應用價值。目前利用銅綠假單胞菌進行生物修復污染環(huán)境的報道有很多，如Lu等[41]從陜西延長油田下寺灣采油廠內(nèi)石油污染土中篩選出一株銅綠假單胞菌，能夠降解熒蒽，在14 d降解效率達到90.2%，對其降解酶進行檢測，發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚1,2-雙加氧酶在其生物降解過程中起主導作用；Song等[42]從經(jīng)過長期擬除蟲菊酯處理的土壤中分理出一株銅綠假單胞菌，能夠高效降解甲氰菊酯。并對氯氰菊酯，溴氰菊酯，聯(lián)苯菊酯和氯氟氰菊酯都有一定的降解能力，通過鑒定降解產(chǎn)物研究了菌株對甲氰菊酯的降解機理。Hoskeri等[43]從造紙廠廢水中分離出一株銅綠假單胞菌，能夠以2 g/L 4-氯苯甲酸為生長底物。

圖10 菌株AY-1在不同農(nóng)藥平板的生長情況。Fig.10 Growth of strain AY-1 on different pesticide plates.

微生物降解技術(shù)是目前比較有前景的一種技術(shù)，微生物可以利用農(nóng)藥為能源，或者自身分泌特定的酶來降解農(nóng)藥及其分解產(chǎn)物。本文研究的降解菌Pseudomonas aeruginosaAY-1產(chǎn)生的降解酶為胞內(nèi)酶，Pseudomonas aeruginosAY-1對敵敵畏、氧化樂果、甲基對硫磷、水胺硫磷、乙草胺和莠去津均具有一定的降解效果，建議未來將研究方向放在固定化方面，以獲得更高效的毒死蜱降解菌株。