沙棘多糖抗運動性疲勞及抗氧化作用的研究

劉雅娜，包曉瑋，王 娟，魏晨業(yè)，白羽嘉

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋柳、黑刺等，屬于胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae）的一類多年生落葉灌木或小喬木。我國沙棘資源非常豐富，占世界沙棘資源的90%以上，生長地主要分布在青海、甘肅、寧夏、西藏、新疆、陜西等地區(qū)[1]。我國古書中就有記載，沙棘被用于中醫(yī)治療各種疾病，具有很強的藥用價值。近年來研究表明沙棘果富含很多生物活性成分，具有良好的抗氧化、抑制腫瘤、降低血糖、降低血脂、免疫調(diào)節(jié)、緩解炎癥、韌帶損傷等功能[2]。

活性多糖是一類主要由葡萄糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、木糖以及半乳糖等10個或10個以上單糖聚合而成的，具有一定生理功能的多聚糖。作為功能性食品開發(fā)使用的活性多糖主要是從一些植物、食用真菌、動物及海洋生物中提取得到，種類繁多[3-4]。我國陸地資源豐富，對于植物多糖功能作用的研究較多。有研究表明，枸杞多糖能夠增加運動小鼠體內(nèi)糖原儲備量，加快清除體內(nèi)乳酸等代謝廢物，對緩解脂質(zhì)過氧化和體力疲勞有一定作用[5]。用不同劑量的桔梗多糖灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)持續(xù)浮水時間增長、血清尿素氮和乳酸含量顯著降低、肝糖原含量有所增加，研究認為桔梗多糖對小鼠具有明顯的抗疲勞作用[6]。同樣，在蒲公英多糖的研究中也得到了有效延長了小鼠力竭游泳時間，抑制血清尿素氮的產(chǎn)生，促進肝糖原儲備的結(jié)論[7]。目前，我國對沙棘的研究主要集中在沙棘中黃酮類和多酚類化合物的提取及功能性研究。如王苗苗[8]對2種新疆沙棘中黃酮、多酚及其抗氧化活性分析，得出2種沙棘的黃酮、多酚、槲皮素、山奈酚及異鼠李素含量與其抗氧化活性具有一定相關(guān)性。王玉[9]研究了沙棘黃酮的分離純化及其抗運動性疲勞作用，明確了純化后的沙棘多糖能顯著的增強機體的運動耐力，有效降低乳酸水平，提高肝、肌糖原的儲備，體現(xiàn)出較好的抗運動性疲勞作用。對于沙棘多糖在抗氧化和抗疲勞方面的功效研究較少。并且，運動性疲勞同時會使機體產(chǎn)生大量的自由基和過氧化物，抗氧化能力同樣也會影響抗疲勞的效果。

因此，本研究通過建立小鼠游泳訓(xùn)練模型，檢測血液中肝糖原的儲備量、血乳酸含量（LA），及體外DPPH自由基清除率等反映運動疲勞程度和抗氧化活性的相關(guān)指標。評價沙棘多糖的抗運動疲勞和體外抗氧化作用，以期為沙棘果功能性產(chǎn)品的開發(fā)和沙棘功效作用的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘 來自新疆阿勒泰地區(qū)；100只雄性KM小鼠 （20±2） g，清潔級，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（批號：SCXK（新）2018003）；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、乳酸（lactic acid，LA）、肝糖元（hepaticr glycogen，HG）試劑盒 南京建成生物工程研究所；1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 美國 Sigma 公司；石油醚、無水乙醇、丙酮、乙醚 均為分析純，天津永晟精細化工有限公司。

XH-B渦旋混合器 無錫沃信儀器制造有限公司；YCL-400T超聲波藥品處理器 濟寧金百特電子有限責(zé)任公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；小鼠游泳箱（100 cm×50 cm×70 cm） 北京智鼠多寶生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘多糖的提取 沙棘干果40 ℃烘干粉碎后過40目篩，石油醚脫脂兩次用80%乙醇回流提取后抽濾，濾渣烘干備用。烘干后的濾渣加入蒸餾水超聲輔助提取后濃縮，采用Sevage法進行脫蛋白五次，用80%乙醇醇沉，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮、乙醚依次順序洗滌后，抽濾烘干即得沙棘粗多糖[10]。沙棘粗多糖的提取率可達8.834%。

1.2.2 分組及給藥方法 將100只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，在第3 d對100只小鼠進行游泳測試，從100只小鼠中篩選出70只身體健康、體重均勻且具有游泳能力的小鼠。在第5 d隨機抽取40只小鼠分為空白組、沙棘多糖低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）劑量組，每組10只，每日上午，每日一次，沙棘多糖低劑量組、沙棘多糖中劑量組和沙棘多糖高劑量組予沙棘多糖0.2 mL/10 g灌胃，空白組予0.9% NaCl注射液等量灌胃，連續(xù)15 d。

1.2.3 負重游泳試驗 各組小鼠末次灌胃30 min后，尾部系上7.5%體重量的鐵絲，放入水深60 cm，水溫（25±0.5） ℃的游泳箱里游泳。用秒表記錄小鼠自入水時開始至頭部沉入水中10 s不能浮出的時間，即負重力竭游泳時間。

1.2.4 肝糖原含量測定 處死各組小鼠，剖腹取肝臟80 mg，分別加入 0.9% NaCl注射液漂洗后用濾紙吸干，稱取60 mg樣本與3倍體積堿液（pH8.0）一起加入試管中，沸水浴煮20 min，流水冷卻。將糖原水解液進一步制備成糖原檢測液，檢測液加入1:4的氯仿漩渦混勻，3500 r/min離心10 min除脂，取上清液0.1 mL用于測定，其他試劑量取嚴格按照試劑盒說明書進行，最終混勻后置沸水中煮5 min，冷卻后于波長620 nm，光徑1 cm，空白管調(diào)零，測定各管吸光度值，計算肝糖原含量。

1.2.5 血尿素氮含量的測定 負重游泳試驗結(jié)束后，斷頭采血，血液在肝素抗凝管中經(jīng)3000 r/min離心10 min。血BUN含量測定時，取血漿0.02 mL，其他試劑量取嚴格按照試劑盒說明書進行，最終充分混勻，37 ℃水浴10min，波長640 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值，計算血BUN含量。

1.2.6 血乳酸（LA）含量的測定 取血清0.02 mL，其他試劑量取嚴格按照試劑盒說明書進行，最終混勻，波長530 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值，計算血LD含量。

1.2.7 DPPH自由基清除率測定 具體操作步驟參照熊芳琪[11]方法進行，以無水乙醇作空白對照，Vc為陽性對照。

1.2.8 ABTS+自由基清除率測定 參照馬曉等[12]方法并改進。配制不同濃度的沙棘多糖溶液各1 mL，分別加入 4 mL ABTS 工作液，混勻后避光反應(yīng)6 min，在734 nm 處測定吸光度，以Vc為陽性對照，按以下公式計算其清除率。

ABTS 自由基清除率（%）=[1-（A1-A）/A0]×100

式中，A1：與 ABTS 溶液混合的試樣的吸光度；A：不含 ABTS 溶液的樣品的吸光度；A0：取代樣品溶液的蒸餾水的吸光度。

1.2.9 沙棘多糖還原能力測定 參照付愛葉等[13]的方法并改進。分別將PBS（0.2 mol/L，pH6.6）、1%的鐵氰化鉀改為2 mL。取離心后上層液 50 μL，加 2 mL蒸餾水和 1%六水氯化鐵0.2 mL，反應(yīng)后測吸光度。

1.3 統(tǒng)計方法

使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)的差異性進行比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準偏差表示，每個指標重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果及分析

2.1 沙棘多糖對小鼠力竭游泳時間的影響

疲勞即是主觀上一種疲乏無力的不適，伴隨著頭昏頭疼、眼花、心率加快等不良反應(yīng)。小鼠負重強迫游泳耐力試驗是用來評價藥物或食物抗疲勞作用的常用試驗?zāi)Ｐ蚚14]。其中游泳持續(xù)時間的長短能夠反映沙棘多糖的抗疲勞程度。由表1可知，沙棘多糖低、中、高劑量組負重游泳時間比空白組分別延長了33.51%、58.89%、55.35%，表明沙棘多糖可以在一定程度上緩解小鼠疲勞狀態(tài)，使得小鼠負重游泳時間增加。其中，沙棘多糖中劑量組的負重游泳時間增加極顯著（P＜0.01），高劑量組負重游泳時間顯著增加（P＜0.05）。表明了不同劑量的沙棘多糖對小鼠的抗疲勞效果也有所不同，中劑量組具有更好的效果。劉興龍等[15]研究了黑參多糖對小鼠抗疲勞作用，也得出黑參多糖中劑量組比高劑量組更能有效提高小鼠力竭游泳時間。

表1 沙棘多糖對小鼠力竭游泳時間的影響Table 1 Effect of PBP on exhaustive swimming time of mice

2.2 沙棘多糖對疲勞小鼠肝糖原含量的影響

糖類是機體運動過程中重要的供能物質(zhì)之一，機體內(nèi)糖儲量是否充足與運動疲勞的發(fā)生有密切的關(guān)系。人體長時間劇烈運動會消耗大量血糖，影響中樞神經(jīng)提供能量，因此人體會感覺疲勞[16]。運動強度和持續(xù)時間關(guān)系著機體內(nèi)肝糖原的分解速度。尤其是長時間運動后，機體為維持正常血糖水平，肝糖原分解速度增加，因此測定肝糖原含量是反映抗疲勞作用的重要指標之一[17]。由表2可知，沙棘多糖低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）劑量組肝糖原含量比空白對照組分別增加12.41%、30.75%、15.34%。該結(jié)果表明沙棘多糖中劑量肝糖原含量相對低、高劑量組有明顯提升，差異極顯著（P＜0.01）。說明沙棘多糖可以通過提高小鼠體內(nèi)肝糖原儲備，從而延緩體內(nèi)疲勞的產(chǎn)生。向超宗等[18]研究了杏鮑菇多糖對小鼠抗疲勞作用得出：同樣給藥濃度為200 mg/kg，杏鮑菇多糖增加肝糖原儲備量為36.92 mg/g明顯低于本實驗沙棘多糖的作用效果。同樣的給藥劑量濃度，楊占群等[19]研究了黑糯玉米多糖對小鼠抗運動疲勞的影響，最高劑量組（400 mg/kg）提高小鼠肝糖原含量為6.68 mg/g，也遠低于沙棘多糖的作用效果。丁玉松等[20]研究了同屬胡頹子科的另一種藥用植物沙棗多糖對小鼠抗疲勞的影響，1000 mg/kg的高劑量組可以提高小鼠體內(nèi)肝糖原的量30.90 mg/g，說明低濃度的沙棘多糖比高濃度的沙棗多糖抗疲勞效果更好。

表2 沙棘多糖對疲勞小鼠肝糖原的影響Table 2 Effect of PBP on the levels of HG infatigued mice

2.3 沙棘多糖對疲勞小鼠血清BUN的影響

機體在正常情況下，血清中BUN含量比較穩(wěn)定。但當(dāng)機體劇烈運動或長時間持續(xù)運動時，糖原和脂肪代謝已不能滿足機體能量所需之時，機體就需要靠蛋白質(zhì)分解進行供能[21]。BUN是由NH3和CO2在肝臟中合成，并通過血液運輸?shù)侥I臟排出體外的除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物。血清BUN水平升高，可以表明機體有氧代謝的能力降低，運動疲勞程度增加[22]。由表3可知，與空白組相比，低、中、高劑量沙棘多糖組的BUN含量分別下降了22.06%，25.89%和23.72%。其中，沙棘多糖中、高劑量組BUN含量極顯著降低（P＜0.01），沙棘多糖低劑量組BUN含量顯著下降（P＜0.05），表明了沙棘多糖可以有效減少血清中BUN含量，加速其排出體外，有助于提高小鼠的運動能力。朱一聞等[23]研究了黃秋葵多糖抗疲勞作用，在空白對照組BUN含量相似的前提下，低和高劑量組也得到了相近結(jié)論，分別是4.47、4.84 mmol/L，略低于本實驗沙棘多糖效果，可能原因是朱一聞等采取小鼠負重6%的訓(xùn)練方法。秦汝蘭等[24]研究了山刺玫果多糖對小鼠抗疲勞的影響，其中高劑量組對血清BUN的清除量與沙棘多糖中劑量組相近5.89 mmol/L。說明在小鼠持續(xù)運動中，植物多糖具有明顯清除血清中BUN的作用，但不同種類的植物多糖效果存在一定的差異。

表3 沙棘多糖對疲勞小鼠血清BUN的影響Table 3 Effect of PBP on the levels of BUN in fatigued mice

2.4 沙棘多糖對疲勞小鼠血清LA的影響

血乳酸是機體在運動產(chǎn)熱過程中酸性代謝產(chǎn)物之一。正常情況下，運動產(chǎn)生的乳酸在肝臟中會被分解為H2O、CO2及熱量，疲勞就會被消除。如果運動過于劇烈或持久，導(dǎo)致體內(nèi)的乳酸來不及被處理，越來越多的乳酸就會抑制參與糖原分解及糖酵解反應(yīng)的磷酸化酶和磷酸果糖激酶的活性，導(dǎo)致能量供應(yīng)的不足[25]。結(jié)果造成肌肉酸痛、發(fā)冷、頭痛等疲勞癥狀。因此，血乳酸水平是評價抗運動疲勞的常見指標[26]。由表4可知，沙棘多糖低、中、高劑量組血清LA分別比空白組低4.4%、21.90%、22.41%，中、高劑量組LA含量極顯著降低（P＜0.01），沙棘多糖低劑量LA含量相比空白組相差較小，結(jié)果表明：沙棘多糖低劑量抗疲勞作用弱于中劑量和高劑量。在相同給藥劑量的前提下，沙愛龍等[27]研究了阿里紅多糖對小鼠抗疲勞作用的影響，得出空白組及不同劑量組血乳酸含量均比本實驗數(shù)據(jù)低，這可能與小鼠負重率較低有關(guān)系，但低、中、高劑量組與空白組相比下降率分別為16.5%、20.76%、23.90%，與本實驗所得趨勢一致。

表4 沙棘多糖對疲勞小鼠血清LA的影響Table 4 Effect of PBP on the levels of LA infatigued mice

2.5 沙棘多糖體外抗氧化活性研究

由圖1可知，沙棘多糖對DPPH自由基清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)趨勢。多糖濃度在0.2～0.6 mg/mL和0.8～1 mg/mL時清除率增長較快，在0.6～0.8 mg/mL時增長較慢。沙棘多糖濃度在0.2～1.0 mg/mL對DPPH自由基清除能力均低于Vc的效果，但在多糖濃度1 mg/mL時Vc清除率為97.45%，沙棘多糖清除率接近Vc清除率為83.43%。陳佳等[28]研究了大連刺參多糖對DPPH自由基清除能力，得出刺參多糖濃度達到1.5 mg /mL時清除率為72.6%，IC50值為0.3 mg /mL。陳紅惠[29]等人研究了底圩茶多糖抗氧化效果，得出多糖濃度在2 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為66.48%，IC50值為0.61 mg/mL。高潔等[30]研究了皂莢多糖的抗氧化能力，得出當(dāng)多糖濃度為4 mg/mL時達到最大清除率為40.2%，IC50值為6.9 mg/mL。陳曉白等[31]研究發(fā)現(xiàn)山銀花多糖對DPPH清除的IC50值為0.941mg/mL。本實驗中沙棘多糖IC50值為0.81 mg/mL，并且濃度在1 mg/mL時清除率最大為83.43%。說明沙棘多糖對DPPH自由基的清除效果比大連刺參多糖、底圩茶多糖弱，比皂莢多糖和山銀花多糖強，具有一定自由基清除活性。

圖1 沙棘多糖對DPPH自由基清除率影響Fig.1 Effect of polysaccharide from Hippophae rhamnoides on DPPH radical

圖2 沙棘多糖對ABTS+自由基清除率影響Fig.2 Effect of polysaccharide from Hippophae rhamnoides on ABTS+ radical

由圖2可知，沙棘多糖在濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，對ABTS+的清除能力逐漸增強。尤其濃度在0.4～0.8 mg/mL范圍內(nèi)清除率快速增長，從27.75%升到94.44%。而0.2～0.4 mg/mL和0.8～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，清除率緩慢增長。沙棘多糖濃度在0.8和1.0 mg/mL時，對ABTS+的清除率分別為94.44%和95.83%，接近同濃度下Vc清除率，分別為99.06%和99.53%，IC50值為2.00 mg/mL。董玉瑋等[32]研究了牛蒡多糖的體外抗氧化效果，得出：多糖濃度在5 mg/mL時，清除率最大為65.78%，IC50值為1.556 mg/mL。DPPH自由基相對比較穩(wěn)定，能與有供氫能力的抗氧化劑反應(yīng)[33]。ABTS+自由基也比較穩(wěn)定，是一種含氮自由基，一般用作反映物質(zhì)總抗氧化能力的測定指標。可見，沙棘多糖對DPPH的清除能力要比ABTS+強。

由圖3可知，沙棘多糖的還原能力與濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。隨著濃度的增加，吸光值增大，還原能力逐漸增強。多糖分子中因為含有的醛羰基，通過電子給予能力，阻止自由基鏈形成，從而具有一定還原作用[10,34]。在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，多糖的還原能力持續(xù)增強，最大吸光值為0.727，但總還原力均明顯低于相同濃度Vc的還原力。李珊等[34]研究了桂七青芒果皮多糖濃度在4.3 mg /mL時，總還原力為0.455。李珊等[35]研究了番石榴多糖濃度在20 mg /mL時，總還原力為0.625。本實驗沙棘多糖在濃度為1 mg/mL時，吸光度值為0.727?？梢钥闯?，沙棘多糖的還原能力要高于桂七青芒果皮多糖和番石榴多糖。

圖3 沙棘多糖的還原能力Fig.3 Total reducing power of polysaccharide from Hippophae rhamnoides

3 結(jié)論與討論

本實驗結(jié)果表明PBP對自由基具有一定清除率，其中對DPPH自由基清除能力較強，對ABTS+自由基的清除能力較弱，其 IC50值分別為0.81、2 mg/mL。PBP的還原能力也隨著濃度的增加逐漸增強。表明PBP具有良好的抗氧化活性。通過建立小鼠負重游泳模型，發(fā)現(xiàn)PBP能夠有效延長小鼠負重游泳時間，增加肝臟中HG的儲存量的同時降低血清中BUN、LA含量，實驗結(jié)果證實PBP具有緩解體力疲勞、增強運動能力的作用。該實驗結(jié)論與任薇[10]、包曉偉[36]及魏晨業(yè)[37]等得出的結(jié)論一致，雖然PBP濃度范圍不同，但隨著濃度的增加，都呈現(xiàn)上升的抗氧化趨勢，尤其是對DPPH自由基和ABTS+自由基清除效果較好。由于本實驗抗氧化活性測定主要采用的是體外研究，具有操作簡便、高效便于重復(fù)及實驗周期短等特點，今后的研究可以采用細胞模型或動物實驗，通過測定血漿、肝臟、心臟及腦組織超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛等抗氧化指標的變化對PBP的抗氧化活性進行深入分析。為今后進一步發(fā)揮沙棘的資源優(yōu)勢，利用沙棘多糖開發(fā)保健食品和治療藥物等深加工產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。