響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮工藝

張 沛，吳 楠，宋志軍，邰正福

（1.云南開放大學(xué)，云南國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500；3.廣西藥用植物園，廣西南寧 530023；4.四川科倫藥物研究院，四川成都 610000）

黃芪是豆科黃芪屬膜夾黃芪（Astragalus membranceus（Fisch.） Bge.）或蒙古黃芪（Astragalus membranceus（Fisch.） Bge.Var mongholicusBge）的根，因具有補(bǔ)氣固表、利尿脫毒之功效，而常添加在保健食品中[1-2]。

現(xiàn)代分析測試研究表明，黃芪中富含多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，其中毛蕊異黃酮作為黃芪的主要活性成分之一，其含量大小常作為黃芪的品質(zhì)參考，具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等活性[3-4]。趙競業(yè)與Li等曾利用毛蕊異黃酮在兩相溶劑中具有不同的分配系數(shù)的特性，采用高速逆流色譜法對其分離純化，但該方法需配備高速逆流色譜儀，成本較高[5-6]。

由于大孔樹脂吸附分離具有操作簡便、吸附量大、選擇性好、成本低和可反復(fù)使用等特點(diǎn)[7-8]，已被廣泛用于多數(shù)天然化合物的分離純化[9-10]，且目前鮮有大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮的研究。為此，本研究通過靜態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)，篩選合適的樹脂型號，并采用單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)考察不同工藝條件對毛蕊異黃酮的純化效果的影響，從而為該物質(zhì)的后續(xù)深入研究提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪 云南東駿大藥房經(jīng)廣西藥用植物園，宋志軍老師鑒定為黃芪的干燥根；毛蕊異黃酮對照品上海阿拉丁試劑有限公司；甲醇、甲酸、乙醇、乙酸乙酯 均為色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水 純化水。

FW100型粉碎機(jī) 永康市云達(dá)機(jī)械設(shè)備廠；U3000型高效液相色譜儀 賽默飛-世爾科技公司；ME 104型電子天平 梅特勒-特利多公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TG18G-II型臺式高速離心機(jī) 鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHA-C型恒溫振蕩器 國華（常州）儀器制造有限公司；AB-8、H103型大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司；D101、DM130型大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；DM 301、HPD-600、HPD-400型大孔樹脂 合肥四峰生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物制備 黃芪完全粉碎后過60目篩，稱取一定質(zhì)量粉末，以8倍質(zhì)量的體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液加熱回流提取3次，合并提取溶劑后減壓回收，所得浸膏溶于50 ℃水，加入乙酸乙酯萃取后，回收溶劑，即得毛蕊異黃酮粗提物[11]。

1.2.2 毛蕊異黃酮含量測定 采用高效液相色譜法測定樣品中毛蕊異黃酮含量[12]。色譜條件：乙腈-水作流動相；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm。準(zhǔn)確稱取毛蕊異黃酮對照品10.0 mg置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入流動相稀釋至刻度搖勻后，分別準(zhǔn)確移取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL于容量瓶內(nèi)，加入流動相稀釋至刻度，搖勻。隨后，分別以毛蕊異黃酮對照品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=12769.2x+12.79 （r=0.9992），另將純化后的洗脫液減壓蒸發(fā)，濃縮干燥后稱重，根據(jù)下式計(jì)算純化產(chǎn)物的毛蕊異黃酮含量。

1.2.3 靜態(tài)吸附-洗脫性能比較 經(jīng)預(yù)處理后的5.0 g七種型號樹脂（H103、D101、AB-8、DM130、HPD-400、DM301、HPD-600）置于錐形瓶內(nèi)，分別加入60 mL 3 mg/mL提取液，于25 ℃振蕩12 h達(dá)到吸附平衡后，過濾，測得溶液中毛蕊異黃酮濃度[13]。飽和吸附的樹脂經(jīng)純水清洗后，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，于相同條件振蕩解吸至平衡[14]，照下列公式計(jì)算不同類型大孔樹脂的吸附量、吸附率、洗脫率及回收率。

式中：c0為提取液中毛蕊異黃酮濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后溶液中毛蕊異黃酮濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；m為樹脂干重，g；cd為洗脫液中毛蕊異黃酮濃度，mg/mL； τe為飽和吸附量，mg/g；Qe為吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R為回收率，%。

1.2.4 吸附等溫曲線 配制體積60 mL濃度分別為0.5、1、2、3、4 mg/mL的提取液，加入裝有5.0 g HPD-400型樹脂的錐形瓶內(nèi)，置于25、30、35 ℃恒溫?fù)u床中，振蕩至飽和吸附后，測得濾液中毛蕊異黃酮的濃度，計(jì)算各自飽和吸附量，繪制吸附等溫曲線，同時(shí)利用Langmuir、Freundlich模型線性擬合，以描述溶質(zhì)與樹脂的相互作用[15]。

1.2.5 吸附動力學(xué)曲線 準(zhǔn)確稱取5.0 g大孔樹脂置于錐形瓶內(nèi)，加入60 mL質(zhì)量濃度為3 mg/mL提取液，于25 ℃振蕩吸附，分別于不同吸附時(shí)間測定溶液中毛蕊異黃酮濃度，以吸附量為縱坐標(biāo)，吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線，采用不同動力學(xué)模型闡明HPD-400型樹脂對毛蕊異黃酮的吸附機(jī)制[16]。

1.2.6 樹脂吸附條件考察

1.2.6.1 上樣液pH考察 配制五份60 mL、3mg/mL的上樣溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH至3、4、5、6、7，以1 mL/min流速上樣至HPD-400樹脂柱內(nèi)，考察不同上樣液pH對樹脂吸附率影響。

1.2.6.2 泄漏曲線繪制 配制3mg/mL、pH為5的不同體積上樣溶液，分別以1、2、3 mL/min流速上樣至HPD-400樹脂柱內(nèi)，分段收集流出液，檢測毛蕊異黃酮濃度，繪制泄露曲線，當(dāng)流出液濃度達(dá)到上樣液濃度10%時(shí)，為樹脂泄漏點(diǎn)；當(dāng)流出液濃度達(dá)到上樣液濃度100%時(shí)，為飽和吸附點(diǎn)[17]。

1.2.7 樹脂解吸條件考察

1.2.7.1 洗脫液濃度考察 分別采用體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液作洗脫液，以1 mL/min流速，洗脫飽和吸附后的HPD-400樹脂，分段收集流出液，檢測毛蕊異黃酮濃度，考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對毛蕊異黃酮洗脫率的影響。

1.2.7.2 洗脫曲線繪制 采用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，分別以1、2、3 mL/min流速，洗脫飽和吸附后的HPD-400樹脂，分段收集流出液，檢測毛蕊異黃酮濃度，繪制洗脫曲線。

1.2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定上樣流速1 mL/min、上樣液體積60 mL、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積140 mL，以上樣濃度（A）、上樣液pH（B）和洗脫液濃度（C）為響應(yīng)因素，回收率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定最佳工藝條件，試驗(yàn)因素水平見表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂型號篩選

由于不同型號大孔樹脂的孔徑、比表面積與極性差異較大，因此比較不同類型樹脂對毛蕊異黃酮的吸附與解吸性能，結(jié)果見表2。H103、HPD-400樹脂的靜態(tài)吸附率與洗脫率分別最高，而HPD-400樹脂對樣品中毛蕊異黃酮的回收率最高，推測是因?yàn)镠103樹脂的比表面積較大，吸附作用較強(qiáng)[18]，而HPD-400樹脂的比表面積適中，且與黃酮化合物具有適當(dāng)氫鍵作用，因此采用HPD-400大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮提取物。

表2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能Table 2 Static adsorption properties of macroporousresin

2.2 樹脂吸附等溫線

圖1為HPD-400樹脂對提取物中毛蕊異黃酮的吸附等溫曲線。在相同吸附溫度下，隨著上樣濃度的逐漸升高，吸附量逐漸增大，但隨著吸附溫度的升高，樹脂吸附量不斷增大，表明該吸附過程為吸熱過程。在25 ℃下，當(dāng)上樣濃度增大至3 mg/mL時(shí)，HPD-400樹脂吸附基本達(dá)到飽和，因此確定上樣濃度2、3、4 mg/mL作為響應(yīng)面因素考察水平。同時(shí)為便于實(shí)際應(yīng)用，后續(xù)試驗(yàn)均選擇在25 ℃下進(jìn)行。

圖1 不同溫度的吸附等溫曲線Fig.1 Adsorption isotherms at different temperatures

表3為不同溫度下，Langmuir與Freundlich模型對吸附等溫線的擬合參數(shù)，兩種模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)均較大（r＞0.97），因此兩種模型均能描述在該濃度范圍內(nèi)的樣品溶液吸附過程，另從Freundlich方程可知，不同溫度的擬合方程中1/n均小于0.5，表明目標(biāo)化合物較易被吸附于HPD-400大孔樹脂內(nèi)[19]。

2.3 樹脂吸附動力學(xué)曲線

圖2為HPD-400樹脂對毛蕊異黃酮的吸附動力學(xué)曲線。隨著吸附時(shí)間的延長，樹脂對其吸附量逐漸增大，在2 h內(nèi)吸附速率較快，隨后放緩，并于7 h達(dá)到平衡。分別采用一級和二級動力學(xué)模型擬合上述吸附過程，結(jié)果見表4。采用二級動力學(xué)模型擬合方程后，其相關(guān)系數(shù)較大，因此該吸附過程更接近于二級動力學(xué)模型特征，吸附過程可能受到外部擴(kuò)散、邊界層擴(kuò)散或顆粒內(nèi)擴(kuò)散控制[20]。

表3 不同溫度的Langmuir與Freundlich模型擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of Langmuir and Freundlich models at different temperatures

圖2 吸附動力學(xué)曲線Fig.2 Curve of adsorption kinetics

表4 吸附動力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters of adsorption kinetics models

2.4 動態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.4.1 上樣液pH對樹脂吸附率的影響 上樣液pH控制提取液中毛蕊異黃酮的離子化程度，進(jìn)而影響其吸附作用。圖3為不同上樣液pH對樹脂的吸附率影響，隨著上樣液pH的增大，樹脂對目標(biāo)化合物的吸附率先升高后降低，這歸因于當(dāng)溶液pH較低時(shí)，過量的氫離子與目標(biāo)化合物競爭吸附樹脂上的活性位點(diǎn)，而溶液pH較高時(shí)，毛蕊異黃酮游離出的陰離子減弱與樹脂的氫鍵作用[21]，因此確定上樣液pH 4、5、6作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖3 上樣液pH對吸附率的影響Fig.3 Effect of pH of sample solution on the adsorption rate of HPD-400 resin

2.4.2 泄漏曲線 隨著上樣液體積的增加，樹脂的吸附位點(diǎn)逐漸飽和，吸附能力下降，流出液中目標(biāo)化合物的濃度逐漸增大，同時(shí)上樣流速過快，使得目標(biāo)化合物與樹脂的接觸時(shí)間較短，可能造成樹脂泄漏點(diǎn)的提前，因此考察不同上樣流速的樹脂泄漏曲線，結(jié)果見圖4。當(dāng)上樣流速分別為1、2、3 mL/min時(shí)，樹脂泄漏點(diǎn)對應(yīng)的上樣體積約為60、40、10 mL，樹脂飽和吸附點(diǎn)則分別約為180、160、140 mL，為了保證上樣液中目標(biāo)化合物被大孔樹脂盡可能吸附完全，因此確定最佳上樣流速為1 mL/min，上樣液體積為60 mL。

圖4 不同上樣流速的樹脂泄漏曲線Fig.4 Leakage curve in different flow rate of sample solution on HPD-400 resin

2.5 動態(tài)洗脫條件優(yōu)化

2.5.1 洗脫液濃度對解吸率影響 圖5為不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對目標(biāo)化合物的洗脫率影響，當(dāng)乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)增大至85%后，洗脫率開始緩慢下降，這歸因于毛蕊異黃酮具有糖苷鍵和多酚結(jié)構(gòu)，極性較弱，易被乙醇從吸附樹脂內(nèi)洗脫，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過大，部分吸附雜質(zhì)也會競爭脫附[22]，因此確定洗脫液濃度75%、80%、85%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖5 洗脫液濃度對洗脫率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate

2.5.2 洗脫曲線 圖6為不同洗脫流速下飽和吸附后樹脂的洗脫曲線，從圖6可知，洗脫流速越快，洗脫曲線峰形愈寬、拖尾現(xiàn)象越明顯，且洗脫液消耗增多，而采用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液以1.0 mL/min流速洗脫時(shí)，洗脫曲線單一、對稱、無明顯拖尾，且對目標(biāo)物的洗脫集中，因此確定最佳洗脫流速為1 mL/min，洗脫液用量140 mL。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的 RSM 分析試驗(yàn)，考察上樣濃度（A）、上樣液pH （B）和洗脫液濃度（C）對毛蕊異黃酮的回收率（Y）影響，結(jié)果見表5。

圖6 不同洗脫流速的洗脫曲線Fig.6 Desorption curve in different flow rates of elution

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the response surface experiments

2.6.2 響應(yīng)曲面方差分析 采用多元回歸擬合上述試驗(yàn)結(jié)果，得到以回收率為目標(biāo)函數(shù)，各參數(shù)編碼值的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=72.10-0.19A-0.10B-0.087C-0.43AB-0.20AC-0.18BC-3.25A2-2.38B2-1.55C2，對其進(jìn)行顯著檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面方差分析Table 6 Variance analysis of response surface experiment

從表6可知，該回歸模型P＜ 0.01，表明該模型回歸效果顯著，R2=0.9840表明模型擬合值與實(shí)際結(jié)果高度相關(guān)，而失擬項(xiàng)P=0.7631＞0.05表明該回歸方程擬合度較高，誤差對試驗(yàn)結(jié)果影響較小，模型可靠。在所有作用因素中，僅二次項(xiàng)A2、B2、C2對目標(biāo)化合物的回收率影響極顯著（P＜0.01）。從表中F值可知，各因素對黃芪毛蕊異黃酮的純化影響大小順序?yàn)椋荷蠘訚舛龋ˋ）＞上樣液pH （B）＞洗脫液濃度（C）。

2.6.3 兩因素間的交互作用 圖7為不同因素的交互作用對回收率的影響，響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對回收率的影響越大[23]，從圖7可知，回收率的響應(yīng)曲面開口朝下，與三個影響因素均呈明顯二次拋物關(guān)系，且隨著上樣濃度、上樣液pH和洗脫液濃度的增大，回收率逐漸升高，并出現(xiàn)極大值，隨后呈不同斜率的下降，另從方差分析結(jié)果與響應(yīng)曲面觀察可知，AB曲線變化最為密集陡峭，其次為AC，影響最小為BC。

圖7 兩因素交互影響回收率的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface of the recovery rates affected by two-factor

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件對二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，得到HPD-400大孔樹脂純化毛蕊異黃酮提取物的最佳工藝條件：體積為60 mL，濃度為2.97 mg/mL，pH為4.9的毛蕊異黃酮提取液以1 mL/min流速上樣至HPD-400型大孔樹脂后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為79.8%乙醇溶液，以1 mL/min流速洗脫，對毛蕊異黃酮的理論回收率為72.9%，實(shí)際回收率為73.2%，與模型預(yù)測值較接近，表明該二次多項(xiàng)回歸模型可預(yù)測各因素與響應(yīng)值間的影響關(guān)系。純化后樣品溶液的色譜圖，見圖8所示，產(chǎn)物中目標(biāo)化合物的含量由2.17%提高至10.36%，約為純化前4.8倍。

圖8 純化前后樣品色譜圖Fig.8 Chromatograms of sample solution before (a)and after (b) purification

3 結(jié)論

由于黃芪毛蕊異黃酮提取物中存在的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，可能影響其活性作用，因此以黃芪毛蕊異黃酮提取物為原料，通過比較不同類型樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能，篩選出合適樹脂后，采用單因素實(shí)驗(yàn)與三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮的最佳工藝條件為：體積為60 mL，濃度為2.97 mg/mL，pH為4.9的毛蕊異黃酮提取液以1 mL/min流速上樣至HPD-400型大孔樹脂后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為79.8%乙醇溶液，以1 mL/min流速洗脫，產(chǎn)物中毛蕊異黃酮的含量由2.17%提高至10.36%，約為純化前4.8倍，該純化工藝操作簡便，目標(biāo)化合物回收率較高，適于推廣使用。