酒精有害使用對(duì)晝夜節(jié)律相關(guān)基因mRNA表達(dá)及睡眠行為的影響

稅霖飛，鄭曉嬌，劉可智

中國(guó)人均酒精消費(fèi)量從2005年的4.1 L增加至2016年的7.2 L[1]。反復(fù)過(guò)度飲酒導(dǎo)致軀體和心理健康損害及其不良的社會(huì)后果被稱為酒精有害使用(HUA)[2]。睡眠障礙普遍存在于酒精使用障礙的各個(gè)階段；在酒精使用障礙的患者中，失眠患病率為36%～91%，而普通人群失眠患病率為10%[3]。

晝夜節(jié)律基因可能參與了HUA及其所導(dǎo)致的一系列行為改變，如睡眠行為，甚至成癮行為[4-5]。本研究探討HUA對(duì)晝夜節(jié)律基因在mRNA表達(dá)以及對(duì)睡眠行為的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 HUA組：為2018年12月至2019年11月期間采用網(wǎng)絡(luò)招募的形式招募持續(xù)性飲酒超過(guò)1個(gè)月或每年都反復(fù)使用酒精的志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《國(guó)際疾病分類》第10版(ICD-10)HUA診斷標(biāo)準(zhǔn)；②酒精使用障礙篩查量表(AUDIT)評(píng)分>7；③男性，18～65歲，右利手；④小學(xué)文化水平及以上，能完成量表評(píng)估、整夜睡眠監(jiān)測(cè)及抽血檢查；⑤對(duì)本研究知情同意，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他精神活性物質(zhì)使用史(吸煙或精神科醫(yī)師處方中精二藥品使用史除外)；②合并嚴(yán)重的軀體疾??；③合并其他精神障礙。終止標(biāo)準(zhǔn)：①被試有權(quán)隨時(shí)提出終止試驗(yàn)的要求；②在試驗(yàn)過(guò)程中若飲酒將自動(dòng)終止試驗(yàn)。對(duì)照組：同期、同樣方式招募健康志愿者；納入標(biāo)準(zhǔn)：①不符合ICD-10 HUA診斷標(biāo)準(zhǔn)；②男性，18～65歲，右利手；③小學(xué)文化水平及以上，能完成量表評(píng)估、整夜睡眠監(jiān)測(cè)及抽血檢查；④對(duì)本研究知情同意，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)、終止標(biāo)準(zhǔn)同HUA組。

1.2 方法

1.2.1 研究流程 入組者入組后在監(jiān)測(cè)第1晚由兩名經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)并取得資質(zhì)的醫(yī)師對(duì)參與者的一般資料進(jìn)行詳細(xì)詢問(wèn)，采用自制的基本信息表，收集入組者的一般資料，主要包括姓名、性別、年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、文化程度、職業(yè)、婚姻、飲酒史、吸煙史、安眠藥使用史等；并進(jìn)行睡眠質(zhì)量評(píng)估；評(píng)估完成后進(jìn)行多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)(PSG)。第1晚為適應(yīng)性監(jiān)測(cè)，被試者按他們習(xí)慣的時(shí)間睡覺(jué)，在他們習(xí)慣的清醒時(shí)間醒來(lái)或記錄8 h后叫醒;第2晚只進(jìn)行正式睡眠監(jiān)測(cè)，在他們習(xí)慣的清醒時(shí)間醒來(lái)或記錄8 h后被叫醒，并進(jìn)行血液標(biāo)本采集。

1.2.2 主觀睡眠狀況評(píng)估 采用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)，評(píng)估被試者最近1個(gè)月的整體睡眠質(zhì)量；包括主觀睡眠質(zhì)量、入睡時(shí)間、睡眠時(shí)間、睡眠效率、睡眠障礙、催眠藥物及日間功能等7個(gè)維度。每個(gè)維度用0～3分的4級(jí)評(píng)分法，總分21分，得分越高表示睡眠質(zhì)量越差。

1.2.3 客觀睡眠狀況評(píng)估 采用Compumedics E-series多導(dǎo)睡眠記錄系統(tǒng)對(duì)入組者進(jìn)行兩晚睡眠監(jiān)測(cè)，第1晚為適應(yīng)性監(jiān)測(cè)，第2晚為正式監(jiān)測(cè)；監(jiān)測(cè)開始前24 h禁止飲酒；采集睡眠數(shù)據(jù)，包括總記錄時(shí)間(TRT)、總睡眠時(shí)間(TST)、睡眠潛伏期(SL)、睡眠效率(SE，TST/TRT)、入睡后清醒時(shí)間(WASO)、非快速眼動(dòng)1期睡眠(N1)、N1占比(N1/TST×100%)、非快速眼動(dòng)2期睡眠(N2)、N2占比(N2/TST×100%)、非快速眼動(dòng)3期睡眠(N3)、N3占比(N3/TST×100%)、快速眼動(dòng)期睡眠(REM)、REM占比(REM/TST×100%)。將第2晚正式監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)根據(jù)美國(guó)睡眠醫(yī)學(xué)會(huì)睡眠分期和相關(guān)事件判讀規(guī)則2.5版進(jìn)行人工分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 晝夜節(jié)律相關(guān)基因mRNA表達(dá)測(cè)定 選取5種與晝夜節(jié)律相關(guān)的基因[鐘基因(Clock)、周期基因1(Per1)、Per2、Per3、大腦和肌肉ARNT樣蛋白-1基因(Bmal1)]進(jìn)行mRNA表達(dá)測(cè)定。抽取入組者晨空腹外周血3 ml，并在2 h內(nèi)分離出白細(xì)胞，加入Trizol試劑后，在-80 ℃條件下保存。使用Trizol法提取總RNA，測(cè)量RNA濃度后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存于-20 ℃。采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)測(cè)定晝夜節(jié)律基因的mRNA表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 HUA組22例、對(duì)照組21名符合入組條件并完成各項(xiàng)評(píng)估和檢測(cè)。兩組年齡、身高、婚姻、安眠藥使用史、文化程度、職業(yè)的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HUA組體質(zhì)量及BMI、吸煙年限明顯高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組晝夜節(jié)律相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較 HUA組在Clock、Per3、Bmal1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料與晝夜節(jié)律相關(guān)基因表達(dá)水平比較例數(shù))

2.3 兩組睡眠狀況評(píng)估比較 HUA組PSQI總分及睡眠效率維度評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。HUA組TST、SE、N2期及REM期時(shí)間明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，SL和WASO明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 睡眠狀況評(píng)估比較

2.4 影響晝夜節(jié)律相關(guān)基因mRNA表達(dá)的因素分析 對(duì)HUA組Clock1、Per1、Per2、Per3、Bmal1基因mRNA表達(dá)與飲酒年限、年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、PSQI評(píng)分、PSG觀察指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，Clock基因mRNA表達(dá)與飲酒年限呈負(fù)相關(guān)(r=-0.434，P<0.05)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HUA組Clock、Per3、Bmal1的mRNA表達(dá)水平較明顯下降， PSQI總分及睡眠效率維度評(píng)分明顯增加，PSG觀察指標(biāo)TST及SE明顯下降，SL和WASO明顯增加。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Clock基因mRNA表達(dá)與飲酒年限呈負(fù)相關(guān)。

晝夜節(jié)律基因的表達(dá)改變使體內(nèi)的代謝活動(dòng)也出現(xiàn)晝夜節(jié)律的紊亂[6]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Clock和Bmal1基因表達(dá)的異?？梢砸鹌咸烟谴x改變，導(dǎo)致葡萄糖耐受性降低和胰島素抵抗[7-8]。晝夜節(jié)律基因通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)水平，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如Clock基因與甲狀腺乳頭癌和結(jié)直腸癌有關(guān)，Bmal1基因與神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及血液系統(tǒng)腫瘤有關(guān)，Per3基因與肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌有關(guān)[9-12]。晝夜節(jié)律基因也參與了血壓和心率、心肌細(xì)胞的代謝、血管內(nèi)皮的功能以及血管的收縮和舒張等的調(diào)節(jié)，如Clock基因與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，Bmal1基因與高血壓與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)[13]。另外，晝夜節(jié)律基因在精神病理學(xué)行為改變中也有著重要的作用[14]。早期帕金森病患者的Bmal1基因表達(dá)改變，并且有睡眠行為的改變[15]。Clock、Bmal1、Per3的基因多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)與季節(jié)性抑郁癥有關(guān)，Clock基因的突變可導(dǎo)致小鼠抑郁樣行為的增加[16-17]。Per3基因的突變將出現(xiàn)更高的特質(zhì)焦慮分?jǐn)?shù)，Clock基因也被發(fā)現(xiàn)與焦慮有關(guān)[16,18]。相關(guān)研究結(jié)論為HUA患者的軀體及精神損害的治療提供更多可供研究的靶點(diǎn)。

本研究表明，HUA者的SL延長(zhǎng)、WASO增加、TST和SE相對(duì)減少；表明這些患者的睡眠障礙在臨床中主要體現(xiàn)在睡眠時(shí)間縮短、睡眠起始困難、睡眠連續(xù)性的破壞。這與大部分相關(guān)研究結(jié)果一致并互為補(bǔ)充：健康人大量飲酒時(shí)SL會(huì)減少，但HUA者SL增加[19]。較對(duì)照組而言，大量飲酒的人出現(xiàn)睡眠異常，表現(xiàn)為 WASO增加、睡眠效率下降[3]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，HUA對(duì)睡眠時(shí)間及效率的影響集中在后半夜，表現(xiàn)為WASO及覺(jué)醒次數(shù)增加[20]。然而對(duì)飲酒的青少年研究結(jié)論略有不同：與對(duì)照組相比，TST和SL沒(méi)有明顯差異，只在下半夜出現(xiàn)WASO增加、SE和N3期睡眠減少[21]。考慮結(jié)論不一致的原因主要與酒精使用年限有關(guān)。此外，雖然本研究也發(fā)現(xiàn)HUA組的N2期和REM期時(shí)間明顯減少，但N2期和REM期占比無(wú)明顯減少，這與TST整體減少有關(guān)，表明酒精對(duì)睡眠各期結(jié)構(gòu)的影響較為有限。

本研究發(fā)現(xiàn)飲酒年限與Clock基因表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)論受到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究結(jié)果的支持：Clock基因突變小鼠顯示出異常的酒精偏好，導(dǎo)致酒精攝入量顯著增加[22]；HUA導(dǎo)致小鼠腹側(cè)被蓋區(qū)中 Clock基因表達(dá)的下降[23]。對(duì)酒精依賴患者的研究也與本文結(jié)論一致，且戒斷1周后Clock基因恢復(fù)也非常有限[4]。但也有研究發(fā)現(xiàn)Clock基因與HUA并不直接相關(guān)，而是只有在共病抑郁癥時(shí)才相關(guān)[24]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Bmal1基因與HUA有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)Clock基因的相關(guān)性[25]。這兩項(xiàng)研究是對(duì)大樣本人群基因多態(tài)性進(jìn)行的研究，因此與本研究在樣本量和實(shí)驗(yàn)方法上存在不同，可能導(dǎo)致的結(jié)果不一致。

本研究的優(yōu)勢(shì)有以下幾點(diǎn)：首先，相比于已經(jīng)出現(xiàn)依賴綜合征的情形，HUA在現(xiàn)實(shí)生活中更加常見(jiàn)，有利于結(jié)果的推廣。其次，比起單純主觀感受，PSG結(jié)果更加精準(zhǔn)地呈現(xiàn)出HUA對(duì)被試睡眠起始和連續(xù)性的損害，而對(duì)睡眠結(jié)構(gòu)的破壞有限。最后，將晝夜節(jié)律基因納入HUA和睡眠障礙之間進(jìn)行分析，結(jié)果表明晝夜節(jié)律基因在其中可能起間接調(diào)節(jié)作用，這為以后的研究者提供另外的思考途徑。本研究不足在于樣本量較少、單一時(shí)間節(jié)點(diǎn)的基因表達(dá)水平不能反映晝夜節(jié)律基因24 h變化、外周血中的晝夜節(jié)律基因表達(dá)只能間接反映實(shí)際在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的因子的水平。

綜上所述，HUA者Clock、Per3、Bmal1基因表達(dá)下降，并且出現(xiàn)了睡眠時(shí)間、效率及睡眠連續(xù)性的下降和睡眠起始困難。這些行為改變的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討，以便能更好對(duì)HUA者出現(xiàn)的睡眠問(wèn)題進(jìn)行干預(yù)。