LC-MS/MS法測定野生青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿含量

楊 林，殷永紅

(1.鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院 附屬醫(yī)院)，湖北 黃石 435000；2. 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000)

青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd. et Wils. 和毛青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd. et Wils. var.cinereumRehd. et Wils. 的干燥藤莖。每年秋末和冬初進行采割，將其扎成把或切成長段后，曬干保存。青風(fēng)藤中含有大量的生物堿類化學(xué)成分，其中以木蘭花堿和青藤堿的含量較高，且研究較為廣泛，二者為該植物中主要的生物堿成分。青風(fēng)藤在中國藥典的2015年版一部中有收載，藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以青風(fēng)藤植物的干燥品來計算，其中生物堿青藤堿的含量要求不能少于干燥品的0.50%。木蘭花堿(magnoflorine，圖1 A)，又名木蘭堿，別名唐松草堿[1]，被證實具有多種生物學(xué)活性，主要包括抗高血壓、緩解焦慮、防治腫瘤、對抗炎癥、抑制生育以及緩解運動產(chǎn)生的疲勞等藥理作用[2～4]；青藤堿(sinomenine，圖1 B)具有抗炎免疫、對抗風(fēng)濕、防治腫瘤和鎮(zhèn)痛等生物活性[5, 6]。二者作為青風(fēng)藤的主要成分，其含量測定對于青風(fēng)藤的質(zhì)量控制具有非常重要的現(xiàn)實意義。

圖1 木蘭花堿(A)和青藤堿(B)的結(jié)構(gòu)式

目前能檢索到多篇研究文獻，報道了采用高效液相色譜法(HPLC-UV)測定中藥青風(fēng)藤及含有青風(fēng)藤中藥復(fù)方中木蘭花堿和青藤堿的含量[7, 8, 9]。筆者擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)建立并驗證野生青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿含量的測定方法，報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS /MS，美國Finnigan公司)；賽多利斯Sartorius BS110S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AS3120A(鋁)型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Thermo Micro17R微量臺式冷凍離心機(美國Thermo公司)；WH-2 微型漩渦混合器(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥

野生青風(fēng)藤采自湖北省宜昌市興山縣。木蘭花堿對照品(含量98.0%)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，青藤堿對照品(含量94.6%)購自中國食品藥品檢定研究院。色譜純甲醇、乙腈購自美國TEDIA(天地)試劑公司；水為娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Kromasil Eternity-5 C18 色譜柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流動相采用水(A)-乙腈(B)進行梯度洗脫(表1)，流速設(shè)置為0.6 mL·min-1；柱溫設(shè)置為30℃，進樣體積為10 μL。

表1 梯度洗脫

質(zhì)譜條件：電離源采用電噴霧離子化(ESI)電離源；掃描方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，在正離子模式下進行監(jiān)測。噴霧電壓3500 V；加熱毛細管溫度(TEM)為270℃；鞘氣流速30 psi；輔助氣流速15 psi；碰撞氣(CID)壓力為1.5 mTorr；源內(nèi)碰撞解離電壓(Source CID)為10 V；被測物木蘭花堿和青藤堿的檢測離子對分別選擇m/z 342.4→297.3和330.2→152.2(圖2)，碰撞電壓分別設(shè)置為24 eV和32 eV。

圖2 木蘭花堿(A)和青藤堿(B)的質(zhì)譜

1.3.2 對照品溶液的制備 取適量的木蘭花堿對照品和青藤堿對照品，分別稱取適量各對照品，精密稱定，并分別置于100 mL容量瓶中，加入適量色譜甲醇溶液使兩種對照品分別溶解完全，然后定容至刻度，配制成木蘭花堿和青藤堿濃度分別為412 μg·mL-1和590 μg·mL-1的兩對照品儲備溶液，并放置于4℃冰箱內(nèi)進行保存。正式實驗前，將兩對照品儲備溶液進行等體積混合。

1.3.3 供試品溶液的制備 將青風(fēng)藤藥材粉末過三號篩，取出約0.1 g該藥材粉末，精密稱定，放置于具塞的錐形瓶中，精密量取并加入20 mL70%的乙醇溶液，密塞，并精密稱定其重量，超聲功率設(shè)置為250 W、頻率設(shè)置為20 kHz，進行20 min的超聲處理后，將錐形瓶在室溫中放冷，再次稱定其重量，用70%乙醇溶液補足超聲處理過程中減失的重量，振搖使之混合均勻，取出1 mL提取液的續(xù)濾液，放置于100 mL容量瓶中，加入純甲醇溶液，振搖均勻，并定容至刻度。再次搖勻后，取出稀釋后提取液適量，以14 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min后，吸取上清液置于進樣小瓶中，每份樣品定量吸取2 μL樣品溶液注入LC-MS/MS系統(tǒng)，進行濃度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性

分別取空白溶液(甲醇)、木蘭花堿和青藤堿混合對照品溶液和供試品溶液采用“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件，進樣2 μL分析，獲得木蘭花堿和青藤堿特征色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法的專屬性良好，被測物木蘭花堿和青藤堿不受雜質(zhì)物質(zhì)干擾，保留時間、分離度及峰形滿足實驗要求，見圖3。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密量取木蘭花堿和青藤堿混合對照品溶液0.01 mL，0.03 mL，0.05 mL，0.10 mL，0.15 mL和0.20 mL置100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成木蘭花堿質(zhì)量濃度為20.6 ng·mL-1，61.8 ng·mL-1，103 ng·mL-1，206 ng·mL-1，309 ng·mL-1和412 ng·mL-1和青藤堿質(zhì)量濃度為29.5 ng·mL-1，88.5 ng·mL-1，147.5 ng·mL-1，295 ng·mL-1，442.5 ng·mL-1和590 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件進樣2 μl進行分析，以被測化合物木蘭花堿和青藤堿的選擇離子色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的各個化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到木蘭花堿的線性回歸方程為Y = 4.509 X + 0.139，相關(guān)系數(shù)為r2= 0.9996；青藤堿的線性回歸方程為Y = 3.915 X + 0.107，相關(guān)系數(shù)為r2= 0.9998。結(jié)果表明，木蘭花堿和青藤堿分別在20.6～412 ng·mL-1和29.5～590 ng·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[10]。

2.3 精密度

取被測物混合對照品(木蘭花堿濃度為206 ng·mL-1，青藤堿濃度為295 ng·mL-1)溶液按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件進樣2 μl，重復(fù)測定6次，計算得木蘭花堿和青藤堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n = 6)分別為1.95%和1.84%，該結(jié)果表明方法精密度良好。

A：木蘭花堿；B：青藤堿；I：甲醇；II：對照品溶液；III：供試品溶液

2.4 重復(fù)性

取同一青風(fēng)藤藥材供試品6份，每份約0.1 g，精密稱定，按“1.3.3 供試品溶液的制備”項下供試品溶液的配制方法進行處理，按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件進行測定，測得青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿的含量平均值分別為1.96 mg·g-1和5.50 mg·g-1，RSD分別為1.93%和2.00%(n = 6)，該結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性

取同一份青風(fēng)藤藥材供試品溶液，分別于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h和24 h按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件進行測定。木蘭花堿和青藤堿峰面積的RSD分別為1.82%和1.65%(n = 7)，該結(jié)果表明青風(fēng)藤供試品溶液中木蘭花堿和青藤堿在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗

取已知含量的青風(fēng)藤藥材供試品6份，每份約0.05 g，精密稱定，按“1.3.3 供試品溶液的制備”項下供試品溶液的配制方法進行處理，并添加適當(dāng)濃度的混合對照品溶液后，使木蘭花堿和青藤堿的理論含量接近測定供試品中木蘭花堿和青藤堿含量的80%，100%和120%，每種理論含量各平行配制3份，過濾后，按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件進樣測定，回收率結(jié)果見表2，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n = 3)

2.7 樣品含量測定

取青風(fēng)藤供試品適量，研細成粉末，過三號篩，取藥材粉末約0.1 g，精密稱定，按“1.3.3 供試品溶液的制備”項下供試品溶液的配制方法處理，按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項下的色譜及質(zhì)譜條件進行測定，測得野生青風(fēng)藤供試品中木蘭花堿和青藤堿的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果 (mg·g-1)

3 討論

青風(fēng)藤作為傳統(tǒng)中藥，具有較高的臨床藥用價值，長期以來廣泛應(yīng)用于臨床，其味苦性平，歸肝、脾經(jīng)，該味藥具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便等功效。青風(fēng)藤主要含有揮發(fā)油、生物堿、脂、甾醇等多類化學(xué)成分，其中生物堿類成分為祛風(fēng)止痛的主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制與免疫調(diào)節(jié)等作用[11]。因此青風(fēng)藤中主要生物堿的含量測定，對于藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。

采用LC-MS/MS法建立了野生青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿含量的同時測定方法，LC-MS/MS法較前人報道的HPLC-UV法極大的縮短了分析時間，靈敏度顯著提高，并提高了分析方法的特異性和專屬性。該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可以應(yīng)用到野生植物中木蘭花堿和青藤堿的含量測定研究中，并為藥用植物的質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)。