陜北關(guān)中地區(qū)大豆胞囊線蟲生理小種鑒定及植物寄生線蟲染色方法改進(jìn)

李 爽，張明君，杭程遠(yuǎn)，師瑜倩，楊 倩，杜 娟，張 強(qiáng)，梁福琴

(1.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))，陜西 延安 716000; 2.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000;3.延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 延安 716000)

1 前言

大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines, Soybean cyst neamatode, SCN)分布于全球大豆主要產(chǎn)區(qū)，是大豆生產(chǎn)上重要的病原之一。大豆胞囊線蟲引起的大豆胞囊線蟲病一般造成大豆產(chǎn)量減少5%～50%，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)可導(dǎo)致絕收[1]。在我國(guó)大豆胞囊線蟲主要分布在東北和黃淮大豆主產(chǎn)區(qū)，并逐漸向貴州、甘肅和廣西等省份蔓延[2～4],陜西地區(qū)大豆胞囊線蟲調(diào)查研究尚未開展。

陜西省包括陜北、關(guān)中和陜南三個(gè)生態(tài)農(nóng)業(yè)區(qū)，陜北地區(qū)以春播大豆為主，在耕作模式上采用玉米、谷子與大豆輪作，在關(guān)中地區(qū)主要實(shí)行豆麥輪作，以夏播大豆為主。陜西省大豆胞囊線蟲線蟲的分布、生理小種類型情況尚未調(diào)查。研究在大豆振興計(jì)劃政策指導(dǎo)下，在國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)體系延安試驗(yàn)站和陜西省豆類產(chǎn)業(yè)體系在落實(shí)中省政策和技術(shù)試驗(yàn)示范推廣的背景下；大豆面積會(huì)有一定程度增加，這勢(shì)必會(huì)擴(kuò)大大豆胞囊線蟲發(fā)生范圍。一旦長(zhǎng)期忽略大豆胞囊線蟲病的蔓延，將造成病害大面積發(fā)生，嚴(yán)重危害陜西省的大豆生產(chǎn)。筆者研究為全面監(jiān)測(cè)陜西省大豆胞囊線蟲的分布與生理小種變化以及大豆胞囊線蟲抗病育種提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)點(diǎn)土樣采集

分別于陜西省岐山縣，陜西省富縣，陜西省甘泉縣，陜西省志丹縣采集大豆田間土樣。采用“Z”字法采集大豆根際5～15 cm的土壤樣本200 g，每個(gè)地區(qū)采集30個(gè)點(diǎn)，將土壤樣本按地區(qū)充分混合后標(biāo)記，用于后續(xù)大豆胞囊線蟲形態(tài)鑒定、生理小種鑒定[5]。

2.2 試驗(yàn)材料與儀器

研究中，供試大豆材料共兩部分，第一部分是大豆胞囊線蟲鑒別寄主，即PI88788、PI90763、Pickett、Peking和Lee74，其中Lee74為感病品種。熒光素二乙酸鹽(Sigma-Aldrich，日本)、丙酮、蒸餾水、品紅、冰醋酸、甘油、濃鹽酸、次氯酸鈉、0.2%水瓊脂。

2.3 研究方法

2.3.1 大豆胞囊線蟲形態(tài)學(xué)鑒定 從各地土樣中挑去顆粒飽滿體表完整的胞囊，參考馮志新的方法在解剖鏡下用解剖刀切下陰門錐，轉(zhuǎn)移到40% H202中漂白處理4 min[6]。依次轉(zhuǎn)移至70%、95%和100%乙醇中脫水，制成玻片。鑒定線蟲種類。

2.3.2 大豆胞囊線蟲小種鑒定法 2019年4月末至6月中旬，在延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所溫室內(nèi)將采集到的病田土參入滅菌沙土，混合均勻后轉(zhuǎn)入15 cm×15 cm的黑色營(yíng)養(yǎng)缽，每盆播種鑒別寄主3粒種子，全部試驗(yàn)重復(fù)5次，定期澆水；30 d后拔出鑒別寄主根系，調(diào)查根系胞囊數(shù)量。大豆胞囊線蟲生理小種鑒別方法按照Riggs發(fā)表的方法進(jìn)行[7]。大豆胞囊鑒別寄主為沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院北方線蟲研究所段玉璽教授提供。試驗(yàn)中采用Golden等使用的鑒別寄主PI88788、Peking、PI90763、Pickett和Lee五個(gè)品種；其中Lee為大豆胞囊線蟲感病對(duì)照。雌蟲指數(shù)(FI，F(xiàn)emale Index)計(jì)算公式如下[8]：

雌蟲指數(shù)(FI)=

若FI≥10為感病，反之，F(xiàn)I≤10則為抗病。

2.3.3 大豆胞囊線蟲染色 實(shí)驗(yàn)中大豆胞囊線蟲染色方法包括兩種，第一種是傳統(tǒng)的次氯酸鈉—酸性品紅染色法，第二種是熒光素二乙酸鹽染色法。次氯酸鈉—酸性品紅染色法按照Byrd和劉維志所描述的方法，根據(jù)根系發(fā)育的不同時(shí)間適當(dāng)調(diào)整甘油脫色的時(shí)間[1, 9]。大豆胞囊線蟲侵染后的大豆根系經(jīng)歷漂白—染色—脫色的三個(gè)關(guān)鍵步驟后在體視顯微鏡下觀察。

熒光素二乙酸鹽染色法是利用熒光素二乙酸鹽(Fluorescein diacetate, FDA)進(jìn)入細(xì)胞后被內(nèi)源性酯酶水解后變成熒光的原理標(biāo)記大豆胞囊線蟲[10, 11]。最初FDA標(biāo)記線蟲主要是通過(guò)熒光形態(tài)區(qū)別線蟲是否死亡。首先，F(xiàn)DA溶于丙酮制備成的母液(5 mg·mL-1)，加入無(wú)菌水制備成1%FDA的染料溶液，在大豆胞囊線蟲孵化至二齡幼蟲后，浸泡在1%FDA的溶液中，置于黑暗的條件下室溫浸泡線蟲6 h以上；標(biāo)記的大豆胞囊線蟲接種前，無(wú)菌水沖洗3次，去除線蟲體壁的FDA溶液，將沖洗完畢的二齡幼蟲混入200 mL 0.2%水瓊脂制成100條·mL-1的線蟲接種混合液，在大豆根系附近接種，5 d后開始取樣檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)在熒光顯微鏡下觀察，為防止根系水分蒸發(fā)，在觀察時(shí)在根系覆蓋適量甘油。

表1 大豆胞囊線蟲生理小種分類系統(tǒng)

3 結(jié)果

3.1 大豆胞囊線蟲形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

陜北和關(guān)中地區(qū)分離到的胞囊呈梨型或檸檬型，體表顏色淺褐色至深褐色，陰門錐下發(fā)有明顯的長(zhǎng)型泡狀突起，雙半膜孔，雙膜孔間有發(fā)育良好的下橋，陰門膜孔長(zhǎng)度，從形態(tài)學(xué)鑒定其為大豆胞囊線蟲。

3.2 大豆胞囊線蟲生理小種鑒定

在陜西甘泉、富縣、志丹和岐山四個(gè)地區(qū)采用田間法鑒定大豆胞囊線蟲生理小種類型，每個(gè)地區(qū)10次重復(fù)。鑒定結(jié)果表明四個(gè)地區(qū)的測(cè)試結(jié)果表明陜北和關(guān)中地區(qū)所檢測(cè)的大豆胞囊線蟲為3號(hào)生理小種(表2)。

表2 陜西地區(qū)大豆胞囊線蟲生理小種鑒定

3.3 熒光素二乙酸鹽代替次氯酸鈉—酸性品紅染色檢測(cè)大豆胞囊線蟲發(fā)育

在大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種侵染感病品種Lee74的5、10和15 d后，利用次氯酸鈉—酸性品紅染色法對(duì)Lee根系中的大豆胞囊染色。被品紅染色的線蟲成紅色，在侵染5 d后呈細(xì)線狀；侵染10 d后大豆胞囊線蟲發(fā)育至三齡幼蟲；侵染15 d后大豆胞囊線蟲發(fā)育至四齡幼蟲，蟲體部分撐開根系表皮暴露在外。利用FDA標(biāo)記法觀察接種大豆胞囊線蟲5 d后的根系，在紅色箭頭標(biāo)記處的線條狀就是在熒光顯微鏡下根系中線蟲的形態(tài)，F(xiàn)DA標(biāo)記的線蟲在紫外光選線下亦可以觀察到。FDA標(biāo)記法樣本處理環(huán)節(jié)簡(jiǎn)單，在樣本可以重復(fù)觀察使用，F(xiàn)DA標(biāo)記的線蟲至多可觀察10 d，在此期間可隨時(shí)掌握大豆胞囊線蟲發(fā)育的情況，此外，F(xiàn)DA標(biāo)記法可以相對(duì)準(zhǔn)確定位胞囊線蟲及合胞體的位置，便于組織病理學(xué)切片的制備，提高實(shí)驗(yàn)效率。

4 討論

大豆胞囊線蟲是一種頑固的植物根系寄生線蟲，嚴(yán)重危害我國(guó)乃至全球的大豆生產(chǎn)，大豆胞囊線蟲在我國(guó)從北至南，由東到西的大豆產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生。大豆是陜北地區(qū)主要的雜糧作物，其結(jié)瘤固氮的功能是陜北地區(qū)養(yǎng)地輪作改善土壤有機(jī)質(zhì)含量的重要作物之一。

研究通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定陜西省陜北地區(qū)為主結(jié)合寶雞岐山地區(qū)的胞囊線蟲為大豆胞囊線蟲；且生理小種為3號(hào)。次氯酸鈉—酸性品紅染色技術(shù)是檢測(cè)植物根系內(nèi)寄生線蟲理想的方法之一，該方法使根系內(nèi)線蟲著色，而根系不著色。通過(guò)體視顯微鏡可以清楚地顯示根系內(nèi)寄生線蟲的數(shù)量、位置以及發(fā)育狀態(tài)。相比較次氯酸鈉—酸性品紅染色方法對(duì)樣品造成不可逆的破壞，利用熒光素二乙酸鹽標(biāo)記大豆胞囊線蟲，可以在活體植株上觀察大豆胞囊線蟲侵染的狀態(tài)，樣本可以重復(fù)利用。此外，利用FDA標(biāo)記線蟲可以準(zhǔn)確定為線蟲誘導(dǎo)取食位點(diǎn)的位置，便于組織學(xué)研究樣本的制備。但FDA標(biāo)記也存在一定的局限性；FDA進(jìn)入細(xì)胞后被內(nèi)源性酯酶水解后變成熒光大約停留10 d左右，此后熒光隨大豆根系生長(zhǎng)逐漸難以檢測(cè)。所以該方法適用于在植物寄生線蟲等其他寄生性病原物前期侵染的研究。

在“大豆振興計(jì)劃”的政策指引下和陜西省豆類產(chǎn)業(yè)體系的推廣下，陜西省大豆面積會(huì)有一定程度的增加，必然也擴(kuò)大了大豆胞囊線蟲發(fā)病范圍。一方面，在接下來(lái)的工作，持續(xù)對(duì)陜西省全域的大豆產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查，掌握全省大豆胞囊線蟲的生理小種分布，達(dá)到動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)全省生理小種及其變化趨勢(shì)的目的。另一方面，更重要的是通過(guò)陜西省全域大豆胞囊線蟲分布以及生理小種的調(diào)查和陜西省大豆種質(zhì)資源抗性鑒定能明確陜西省大豆胞囊線蟲發(fā)生以及綜合防治以及陜西省大豆胞囊線蟲抗病育種工作提供一定的理論參考。