芪防顆粒薄層色譜供試品溶液制備的優(yōu)化

王迎陽

(銅川市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 銅川 727031)

芪防顆粒由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)、百合等中藥材配伍制成，益氣固表、滋陰潤肺。臨床上用于感冒、流感等的治療以及病毒性肺炎包括新冠肺炎、SARS等的預(yù)防。黃芪是芪防顆粒處方中重要的一味藥，且黃芪中的化學(xué)成分繁多，其中皂苷類成分(AMS)是重要的藥效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體的抗病能力抗病毒作用[1]。黃芪甲苷是AMS主要的有效成分，含量相對(duì)最高，在《美國藥典》《歐洲藥典》《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中黃芪甲苷常作為黃芪的定性定量指標(biāo)，是一切標(biāo)準(zhǔn)制定的基礎(chǔ)?！盾畏李w粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》鑒別中黃芪甲苷項(xiàng)下供試品溶液的制備采用回流和液-液萃取，步驟多，易造成黃芪甲苷的流失，在檢驗(yàn)結(jié)果上容易造成誤判，且耗時(shí)長，不利于快速檢測(cè)。本文參考梁曜華等[2]連續(xù)單因素法優(yōu)化黃芪中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法和藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[3]，列舉出能夠影響黃芪甲苷提取效率的3個(gè)主要因素[4-6]。通過對(duì)3個(gè)因素的枚舉驗(yàn)證和方法學(xué)考察，使供試品溶液的制備方法得到優(yōu)化且能做到快速鑒別。

1 材料

1.1 儀器

CAMAG LINOMAT5自動(dòng)點(diǎn)樣器(瑞士卡瑪公司)；ME204T型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；MS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；DHG-9203AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；TH-II型薄層加熱器(上海科哲生化科技有限公司)；紫外觀察箱(瑞士卡瑪公司)。

1.2 試劑

黃芪甲苷對(duì)照品(CAS No.84687-43-4，批號(hào)110781-201616，HPLCV級(jí)，含量97.4%)購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、正丁醇、氨水為分析純；娃哈哈純凈水；硅膠G薄層板(青島海洋化工分廠)。

芪防顆粒(批號(hào)200420)由銅川市礦務(wù)局中心醫(yī)院提供；自制陰性對(duì)照按《芪防顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中處方除去生黃芪后按制法制成陰性對(duì)照清膏。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

按照《中國藥典》2015年版四部薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑。

2.2 溶液的制備

取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.63 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備過程的優(yōu)化主要考慮了可能影響芪防顆粒中黃芪甲苷提取效率的3個(gè)主要因素：①提取方式;②是否用正丁醇萃取；③氨試液加入時(shí)機(jī)，進(jìn)行枚舉，供試品溶液制備方法枚舉示意見圖1。

圖1 供試液制備方法的枚舉示意圖

方法A(《芪防顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》方法)：取樣品15 g研細(xì)，精密加入甲醇100 mL，加熱回流2 h，放冷，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液充分洗滌3次，每次40 mL，棄去洗滌液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

方法B：取樣品15 g研細(xì)，精密加入甲醇100 mL，加熱回流2 h，放冷，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)影痹囈?5 mL，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

方法C(堿液直接提取)：取樣品15 g研細(xì)，精密加入甲醇-氨試液(4∶1)100 mL，加熱回流2 h，除不用氨試液洗滌外后續(xù)步驟與方法A一致。

方法D：取樣品15 g研細(xì)，精密加入甲醇-氨試液(4∶1)100 mL，加熱回流2 h，除不用氨試液洗滌外后續(xù)步驟與方法B一致。

方法E、方法F、方法G、方法H操作分別對(duì)應(yīng)方法A、方法B、方法C、方法D，將加熱回流2 h變?yōu)槌?250 W，40 KHz)30 min。

2.3 制備方法的優(yōu)選

取芪防顆粒研細(xì)，分別按上述8種制備方法制備供試品溶液，與對(duì)照品溶液分別點(diǎn)樣在同一硅膠G薄層板上，按照色譜條件進(jìn)行展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置薄層加熱板上于105℃加熱至顯色清晰，置紫外觀察箱(365 nm)下檢視，樣品色譜與對(duì)照品色譜主斑點(diǎn)位置統(tǒng)一，結(jié)果見圖2。

S為黃芪甲苷對(duì)照品色譜；1～8為方法A～H制備供試品溶液色譜

通過對(duì)圖2中A和E、B和F、C和G、D和H色譜圖的比較，發(fā)現(xiàn)超聲法的主斑點(diǎn)較回流法更明顯；通過對(duì)圖2中A和C、B和D、E和G、F和H色譜圖的比較，發(fā)現(xiàn)甲醇-氨試液(4∶1)提取的主斑點(diǎn)較氨試液洗滌更明顯；通過對(duì)圖2中A和B、C和D、E和F、G和H色譜圖的比較，不用正丁醇萃取的主斑點(diǎn)較用正丁醇萃取更明顯。

方法A～H這8種方法從供試品的制備至得到結(jié)果耗時(shí)分別為5 h、3 h、4 h、2.5 h、3 h、2 h、2.5 h和1.5 h。

通過對(duì)比主斑點(diǎn)顯色情況和制備耗時(shí)的分析，優(yōu)選出方法H進(jìn)行供試品溶液的制備。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

取自制陰性對(duì)照清膏2份置于250 mL錐形瓶中，第一份50 mL，第二份30 mL，在第一份中加入黃芪甲苷對(duì)照品3 mg，按照方法H制備陰性對(duì)照加標(biāo)溶液、陰性對(duì)照溶液。按色譜條件，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照加標(biāo)溶液、陰性對(duì)照溶液和黃芪甲苷對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上展開，并顯色。結(jié)果顯示其他成分對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定無明顯干擾(見圖3)。

S為黃芪甲苷對(duì)照品色譜；1為陰性加標(biāo)對(duì)照溶液色譜；2為供試品溶液色譜；3為陰性對(duì)照溶液色譜

2.4.2 耐用性實(shí)驗(yàn)

按色譜條件，將方法H制備的供試品溶液和黃芪甲苷對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，在3℃和35℃下展開，結(jié)果表明溫度的變化對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定無明顯干擾(見圖4)。

S為黃芪甲苷對(duì)照品色譜；1為供試品溶液色譜

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次芪防顆粒，平行5份，每份15 g，分別制成供試品溶液，與黃芪甲苷對(duì)照品溶液的點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按色譜條件進(jìn)行展開，結(jié)果顯示5份平行樣本結(jié)果一致(見圖5)。

S為黃芪甲苷對(duì)照品色譜；1～5為平行供試品溶液色譜

3 結(jié)論

(1)通過8種制備方法對(duì)應(yīng)薄層色譜圖的比較，優(yōu)化后的方法H顯色更清晰，能更加準(zhǔn)確地判斷樣品中是否含有黃芪甲苷，可用于芪防顆粒的定性分析。耗時(shí)由5 h縮短為1.5 h，可用于新冠疫情防控的藥品的檢驗(yàn)，檢驗(yàn)時(shí)間的縮短有利于藥品快速投放市場。

(2)優(yōu)化后的供試品溶液的制備方法具有良好的專屬性、耐用性、重復(fù)性，且簡單易行，適合大量樣本的檢測(cè)。可為其他黃芪甲苷含量較低中成藥的質(zhì)量控制提供參考。