10例腎單位腎癆患兒的臨床特征和基因變異分析

方韶晗 鄧 芳 徐達(dá)良 朱 穎 周慧琴 吳 琳 朱亞鳳 彭 寅

腎單位腎癆(nephronophthisis，NPHP)是一種少見的常染色體隱性遺傳的慢性小管間質(zhì)性疾病，主要形成腎囊腫病變，是兒童及青少年終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)常見原因之一。主要分型為嬰兒型、少年型、青年型，少年型最為常見。其起病較為隱匿，臨床表現(xiàn)為多尿、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、貧血、腎功能異常等非特異癥狀，10%～20%的患者存在腎外表現(xiàn)，主要累及眼、肝、腦、骨骼等。NPHP由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性，腎臟病理改變不顯著，造成臨床診斷困難，因此主要依賴于基因診斷?，F(xiàn)有22個(gè)相關(guān)致病基因已被證實(shí)與NPHP發(fā)病相關(guān)，包括NPHP1～20、NPHPL1、NPHPL2，但只有約40%患兒能夠檢測(cè)到已知致病基因，其中NPHP1缺陷致病為最常見，占19.7%～29.4%。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均主張對(duì)臨床疑似病例進(jìn)行基因檢測(cè)確診。本研究對(duì)確診的10例患兒資料進(jìn)行總結(jié)，分析該病的臨床表型及基因突變特點(diǎn)，以提高對(duì)本病的認(rèn)識(shí)，為臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2020年6月安徽省兒童醫(yī)院腎內(nèi)科就診、并經(jīng)基因檢測(cè)確診為NPHP的10例腎臟病患兒病歷資料。對(duì)患兒臨床資料，包括病史、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)資料、家族史進(jìn)行回顧性分析。

1.2 高通量測(cè)序方法 基因檢測(cè)方法均為統(tǒng)一的高通量下一代測(cè)序(nest-generation sequencing, NGS)與遺傳病分析流程。收集患兒及其家庭成員外周血2～3 mL，提取基因組DNA(康為世紀(jì)血液基因組提取試劑盒)。采用家系全外顯子組測(cè)序(基因測(cè)序由北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司完成)，用捕獲探針(IDT公司xGen? Exome Research Panel v1.0)將目標(biāo)區(qū)域(51 Mb)DNA片段進(jìn)行富集。使用 NovaSeq 6000系列測(cè)序儀(illumina公司)進(jìn)行高通量測(cè)序(PE150)，對(duì)測(cè)序合格的數(shù)據(jù)，采用Burrows-Wheeler 軟件分析單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNVs)和小片段插入/缺失變異(small insertions and deletions，Indels)。根據(jù)同批次樣本的reads數(shù)比對(duì)，分析外顯子水平拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNV)。使用在線分析系統(tǒng) (http://Chigene.org) 對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋，過(guò)濾公共人群頻率數(shù)據(jù)庫(kù)(1000Genomes、dbSNP、ESP和gnomAD)和本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)的高頻變異，結(jié)合患兒臨床表型、遺傳模式、家系共分離、變異位點(diǎn)致病性等信息篩選候選變異位點(diǎn)。對(duì)篩選的SNVs和Indels進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。通過(guò)qPCR進(jìn)行外顯子水平拷貝數(shù)變異的驗(yàn)證。依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)2015年制定的“遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南”和Clingen(ClinGen, http://www.clinicalgenome.org)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行危害性評(píng)級(jí)。

1.3 觀察指標(biāo) 記錄并分析10例患兒的家系圖，臨床特征、基因檢測(cè)結(jié)果及患兒治療預(yù)后。

2 結(jié)果

2.1 家系圖 共10例患兒通過(guò)基因檢測(cè)確診為NPHP。所有患兒及其父母(標(biāo)準(zhǔn)家系)的分子遺傳學(xué)特征見圖1。

圖1 10例患兒家系圖

2.2 臨床特征 10例患兒中，男性6例，女性4例，確診年齡4～14歲，中位年齡10.5(6,12.25)歲。其中3例患兒來(lái)自2個(gè)不相關(guān)的近親婚配家庭(患兒2、7、8)。所有患兒均以不同程度的腎功能不全為首發(fā)癥狀，就診時(shí)9例診斷為慢性腎臟病5期，1例年齡最小的患兒(患兒8，4歲)為2期。7例患兒有腎病家族史，其中患兒8和患兒10因親屬患病而行常規(guī)體檢時(shí)被診斷。腎功能不全的癥狀和體征包括：貧血(7/10例)、夜尿增多(1/10例)、水腫(1/10例)，均有面色蒼黃、乏力等表現(xiàn)；除患兒4合并有手、足、膝關(guān)節(jié)畸形及弱視，余9例患兒均無(wú)顯著的腎外系統(tǒng)病變。尿液檢查：尿蛋白陽(yáng)性3例，定性+-～2+，余7例尿蛋白陰性；24小時(shí)尿蛋白定量除患兒8門診就診，未留取標(biāo)本，余9例均有不同程度升高，24小時(shí)尿蛋白156～1 095 mg、尿α1-微球蛋白34.2～99.3 mg/L、尿β2微球蛋白0.98～724 mg/L、尿微量白蛋白21.82～1 679.3 mg/L、視黃醇結(jié)合蛋白19.82～50.9 mg/L、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白5.8～83.9 mg/L、尿免疫球蛋白IgG及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶升高不明顯。影像學(xué)檢查：泌尿系超聲檢查提示腎臟彌漫性病變及體積縮小8例，合并多發(fā)及單發(fā)小囊腫3例。僅1例行腎臟病理檢查，病理學(xué)提示慢性小管間質(zhì)性腎炎、NPHP。

2.3 基因檢測(cè)結(jié)果及診斷 60%(6/10)的患兒均檢出NPHP1基因純合性缺失(Exon1-20del)，診斷為NPHP1型(NPHP1，MIM: #256100)；2例(20%，患兒9、10，為同胞)鑒定為INVS c.2887C>T(p.Q963*)雜合性致病變異，診斷為NPHP2型(NPHP2，MIM: #256100)；1例(10%)為WDR19基因c.1489G>T (p.V497F)和c.1982+2T>C復(fù)合雜合變異，診斷為NPHP13型(NPHP13，MIM: #614377)；1例檢出TTC21B基因c.1656_c.1659delTCTG(p.C552Xfs*1)和c.1552T>C(p.C518R)復(fù)合雜合變異，診斷為NPHP12型(NPHP12，MIM: #613820)。所有鑒定的基因變異均經(jīng)real-time PCR或Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并根據(jù)ACMG指南判定為致病性(pathogenic)或可能致病(likely pathogenic)變異。患兒1～8中鑒定基因變異與家系內(nèi)的臨床表型呈現(xiàn)共分離，即符合孟德爾遺傳性疾病規(guī)律(見圖1)。根據(jù)檢出的INVS基因變異致病性、患兒家族病史，INVS變異與患兒表型共分離，以及復(fù)習(xí)文獻(xiàn)NPHP2案例報(bào)導(dǎo)的遺傳學(xué)特征，綜合分析后認(rèn)為患兒9、10為INVS雜合性變異導(dǎo)致的NPHP2。

2.4 治療 10例患兒目前均進(jìn)行腹膜透析腎臟替代治療，其中患兒1、患兒2、患兒7已經(jīng)在腹膜透析過(guò)渡的基礎(chǔ)上進(jìn)行了腎移植，目前未出現(xiàn)腎移植術(shù)后的相關(guān)并發(fā)癥，恢復(fù)良好，監(jiān)測(cè)腎功能正常。其他患兒目前腹膜透析治療順利，定期入院評(píng)估。

3 討論

NPHP多在疾病晚期出現(xiàn)肝腎囊腫表現(xiàn)，尤其在疾病早期部分微小囊性病變不能被影像學(xué)發(fā)現(xiàn)。本組10例患兒中有6例未發(fā)現(xiàn)腎臟囊腫，故影像學(xué)只能作為參考依據(jù)，無(wú)法確診。腎臟病理的典型表現(xiàn)為腎小管基底膜完整性破壞，出現(xiàn)增厚、變薄、分層或者撕裂，遠(yuǎn)曲小管和集合管擴(kuò)張或囊腫形成，腎臟間質(zhì)纖維化或者單核細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究中僅一例患兒進(jìn)行腎活檢，病理改變?yōu)槁孕」荛g質(zhì)性腎炎，符合NPHP特征性的病理改變，臨床上多數(shù)患兒發(fā)病時(shí)已處于ESRD，已無(wú)法行腎活檢檢查明確發(fā)病原因，因此隨著基因診斷技術(shù)的發(fā)展，基因檢測(cè)已被公認(rèn)為NPHP確診的唯一有效方法。

NPHP本質(zhì)上是一種纖毛病，即由于纖毛結(jié)構(gòu)或功能缺陷導(dǎo)致的腎組織病變，因此在理論上，NPHP患者可能合并有多系統(tǒng)病變，包括視網(wǎng)膜退化、肝纖維化、小腦發(fā)育不良和智力障礙。在以往報(bào)導(dǎo)的NPHP1(MIM: #256100)案例中，大多非近親婚配家庭的患者有包含NPHP1基因在內(nèi)的純合性2q13微缺失，表明該微缺失是一個(gè)熱點(diǎn)變異。這種染色體微缺失致病的分子遺傳機(jī)制暗示NPHP1患者的表型異質(zhì)性，可伴或不伴其他腎外表現(xiàn)(如眼、腦、肝、心臟等)，可能與微缺失的范圍有關(guān)。本研究納入的患者60%為NPHP1基因純合缺失，提示2q13微缺失可能也是我國(guó)人群熱點(diǎn)變異。此外這6例患者中除了2例有高血壓外，均無(wú)其他腎外表現(xiàn)，這可能與人群異質(zhì)性或涉及缺失實(shí)際區(qū)域大小有關(guān)。

NPHP1基因純合缺失的發(fā)生機(jī)制也可能與單親二倍體(uniparental disomy，UPD)有關(guān)，這類患者可能檢出“新發(fā)(de novo)”的NPHP1雜合性缺失，加上遺傳自父母的1條雜合性NPHP1雜合性缺失染色體構(gòu)成純合性缺失。本研究中，測(cè)序分析表明，患兒2的2號(hào)染色體(chr2:108443511-122288615)存在13.8 M的UPD，此區(qū)域包含NPHP1基因，但由于父母為近親，無(wú)法通過(guò)數(shù)據(jù)分析判斷該UPD是父源還是母源，僅根據(jù)NPHP1的變異情況，推斷發(fā)生了父源UPD。INVS基因又名NPHP2，導(dǎo)致嬰兒型NPHP，患兒通常表現(xiàn)為囊性腎臟腫大，4歲以內(nèi)進(jìn)入終末期腎病。Halbritter等在2例青少年型NPHP患者中發(fā)現(xiàn)，INVS基因單雜合變異致病的案例，表明目前對(duì)于INVS相關(guān)NPHP的了解還有待深入，除罕見的顯性遺傳方式(環(huán)境因素等可能造成外顯率改變)外，不排除潛在的雙基因遺傳、修飾基因缺陷等特殊的遺傳方式?；純?和10為親姐弟，在INVS基因只檢測(cè)到c.2887C>T(p.Q963*)雜合變異，在該基因上未發(fā)現(xiàn)其他可疑變異位點(diǎn)。筆者推測(cè)INVS基因?qū)е禄颊吣挲g分布廣泛，從嬰兒型到青少年型NPHP發(fā)生均與該基因變異有關(guān)。本研究納入的患兒9和10臨床表現(xiàn)與INVS基因相關(guān)度高，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有單個(gè)雜合致病性變異，提示可能存在另外一個(gè)致病性變異。由于全外顯子組測(cè)序只對(duì)基因組編碼區(qū)域進(jìn)行捕獲，無(wú)法檢測(cè)到深度內(nèi)含子區(qū)變異，同時(shí)對(duì)單個(gè)外顯子缺失/重復(fù)檢測(cè)不夠靈敏，也無(wú)法檢測(cè)到倒位、易位等復(fù)雜變異類型。全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)在檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)變異方面有很大優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)單個(gè)外顯子缺失/重復(fù)靈敏度高，通過(guò)WGS，有望進(jìn)一步探索該2例患兒遺傳病因。

近些年，新鑒定的NPHP相關(guān)基因包括TTC21B和WDR19，兩者均編碼參與纖毛功能調(diào)控的蛋白質(zhì)，所導(dǎo)致的NPHP被分別命名為NPHP12(MIM: #613820)和NPHP13(MIM: #614377)，但已知的報(bào)導(dǎo)很少。Davis等在2個(gè)不相關(guān)家庭的NPHP患者中均鑒定了TTC21B純合性變異，然而作者并未提供詳細(xì)的臨床資料。根據(jù)本研究患兒6的臨床特征，中國(guó)兒童NPHP13與NPHP1的表型類似，并未發(fā)現(xiàn)顯著的腎外病變。目前，已報(bào)導(dǎo)的WDR19缺陷導(dǎo)致NPHP13病例均有兒童期-青少年期的腎外病變或異常，包括視網(wǎng)膜微動(dòng)脈瘤、發(fā)育遲緩、多種睫狀體病變、肝內(nèi)膽管擴(kuò)張、胰腺和肝囊腫等，與本研究患兒4的眼異常特征一致，同時(shí)患兒4合并有四肢關(guān)節(jié)受累，可能與不同遺傳背景，或合并其他先天性疾病有關(guān)。因此，本研究中所鑒定的NPHP12和NPHP13案例，為該類疾病的基因型-表型譜提供了寶貴的研究材料。

綜上所述，本研究NPHP患兒起病隱匿，早期臨床表現(xiàn)不顯著，而多數(shù)患兒在腎功能嚴(yán)重受損前，往往沒有腎活檢的適應(yīng)證，因此臨床診斷NPHP時(shí)，大多已進(jìn)入慢性腎臟病5期。因此建議對(duì)于兒童-青少年期診斷困難、特別是有家族史的腎病患者，考慮一線進(jìn)行基因檢測(cè)。本研究中10例患兒均發(fā)病隱匿，最長(zhǎng)確診時(shí)間為6年。如能早期確診，既能延緩慢性腎功能衰竭的病程，又能減少藥物不良反應(yīng)發(fā)生，還可以進(jìn)行家庭生育指導(dǎo)。此外，本研究鑒定了罕見的NPHP12和NPHP13案例，表明以往對(duì)于TTC21B和WDR19變異致病可能是低估的，在腎病患者的基因檢測(cè)中，應(yīng)充分考慮新致病基因的可能性。