熒光定量PCR技術在食品快速檢測中的應用

丁博群，劉珊娜

（天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津 300392）

隨著生活水平的提高，人們對食品的質(zhì)量安全關注度逐漸增強。傳統(tǒng)的食品檢測方法耗時較長，無法滿足市場的需求，發(fā)展食品快速檢測技術成為必然趨勢?？焖贆z測是指實驗樣品前處理簡單、所用試劑較少、制備后可較長時間保存、操作簡便、對操作人員要求較低且能夠在較短時間內(nèi)完成檢測分析并得出結(jié)果的檢測方法[1]。此方法可以快速篩查存在問題的產(chǎn)品，及時避免生產(chǎn)企業(yè)的損失和食品安全事件的發(fā)生。目前常用到的快速檢測技術有化學比色法、酶抑制法、免疫分析技術、分子生物學技術、生物芯片技術、生物傳感器技術等[1]。本文分析了以分子生物學為基礎的熒光定量聚合酶鏈式反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術在食品快速檢測中的研究現(xiàn)狀和應用熱點，為完善食品快速檢測體系提供參考。

1 熒光定量PCR的基本原理及發(fā)展歷程

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）又稱為PCR技術，是一種在生物體外把少量初始樣品中的目的基因DNA片段進行大量擴增的核酸合成技術。熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術是在PCR過程中引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，產(chǎn)物不斷增加，熒光信號強度也等比例增加，每經(jīng)過一個循環(huán)收集到一個熒光強度信號，根據(jù)熒光強度的變化來監(jiān)測產(chǎn)物量的變化從而得到一條熒光擴增曲線，實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析[2-3]。擴增曲線一般分為停滯期、指數(shù)增長期和飽和期，由于只有指數(shù)增長期的擴增曲線是存在線性關系的，所以選擇在這一時期進行分析[4]。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR采用光譜檢測，避免了耗時的凝膠電泳，更加快速便捷，提高了檢測的準確性、靈敏性和特異性[5]。1992年熒光定量PCR技術被首次報道[6]，隨后，SYBR Green染料、Eva Green染料、TaqMan探針、分子信標等均出現(xiàn)在熒光定量PCR的應用中。1999年Va?tilingom等[7]通過熒光定量PCR技術測定食品中的轉(zhuǎn)基因玉米和大豆，這是熒光定量PCR首次報道應用于食品檢測中。二十一世紀以來，熒光定量PCR技術逐漸開始應用于檢測食品中致病菌、摻雜摻假、過敏原、寄生蟲、抗性基因、可食用昆蟲等。近年來，又出現(xiàn)了將熒光定量PCR技術與其他技術相結(jié)合的檢測手段，比如采用免疫磁分離與qPCR結(jié)合的方法快速檢測大腸桿菌[8]；采用疊氮溴化丙錠（PMA）與qPCR聯(lián)合的方法檢測生菜中的沙門氏菌[9]；基于GNM C7-8 qPCR系統(tǒng)對8種食源性致病菌進行檢測分析[10]；利用芯片與qPCR結(jié)合的技術鑒別羊肉摻雜摻假[11]；將微生物分子檢測儀與qPCR結(jié)合對食品中沙門氏菌進行檢測[12]；建立了熒光定量PCR技術與微滴數(shù)字PCR技術結(jié)合的檢測方法用于精確定量肉制品中的羊肉成分[13]。除此之外還有一些在試劑盒上的改進，比如王斌[14]研發(fā)了一種帶有無需電路結(jié)構(gòu)和額外照明光源即可發(fā)出與熒光試劑相同熒光色并達到指示效果的自發(fā)光指示燈管，使熒光定量PCR技術可以在更多樣的環(huán)境下應用，操作更加便利。

2 熒光定量PCR的分類

2.1 熒光染料法

常用的熒光染料包括SYBR GreenⅠ、Eva Green和Pico Green等，其中SYBR GreenⅠ應用最為廣泛[15]。SYBR GreenⅠ不結(jié)合單鏈的DNA，游離狀態(tài)下不受激發(fā)，無信號檢測，能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生強烈的熒光，其信號強度與體系中的雙鏈DNA含量成正比。SYBR GreenⅠ的最大優(yōu)勢在于可用于監(jiān)測雙鏈DNA序列的擴增，對DNA模板沒有選擇性，通用性強，使用方便，不需要設計和合成復雜的探針，靈敏度高，價格便宜。但是SYBR GreenⅠ會與體系中非特異性的雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生假陽性的信號，影響實驗結(jié)果的準確性[16]。

2.2 熒光探針法

熒光探針法分為水解探針和雜交探針兩種。TaqMan探針是最常見也是應用最廣泛的水解探針，可以與互補靶序列進行特異性結(jié)合。其5’端標記報告熒光基團，3’端標記熒光淬滅基團，3’端的熒光淬滅基團可以吸收5’端的報告熒光基團所發(fā)射的熒光能量，檢測不到報告熒光基團的信號；而在PCR延伸時，熱穩(wěn)定DNA聚合酶5’端→3’端的核酸外切酶活性將熒光探針降解，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，就可以檢測到報告基團的熒光[17-18]。TaqMan探針檢測的是累積熒光，它的強度與PCR產(chǎn)物的擴增量有關。TaqMan探針的優(yōu)勢在于特異性高，引物設計相對簡單，重復性好；局限性表現(xiàn)在只適合特定的目標，熒光探針不能自行標記，合成價格較高。雜交探針中應用最多的是分子信標[4]。分子信標是一個呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的閉合環(huán)狀雙標記寡核苷酸探針，兩端分別標記報告熒光基團和熒光淬滅基團，初始階段兩端的堿基互補配對，稱為莖狀區(qū)，目的基因擴增時，莖狀區(qū)在加熱條件下解鏈由環(huán)狀變?yōu)殒湢?，目的基因與原來的環(huán)狀區(qū)特異性結(jié)合，報告熒光基團被激發(fā)釋放熒光[4,19-20]。

3 熒光定量PCR技術在食品檢測中的應用領域

3.1 食源性致病菌的檢測

目前，熒光定量PCR技術在食源性致病菌的檢測方面應用廣泛，相對其他方面較為成熟，已有在多種類型食品中檢測不同致病菌的研究報道。表1總結(jié)了近年來部分研究情況，其中TaqMan探針法使用相對較多。

3.1.1 肉制品中食源性致病菌的檢測 肉制品中蛋白質(zhì)和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，存在化學性污染和生物性污染等風險。肉制品中常見的食源性致病菌主要包括沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌等。楊旭[31]使用免疫磁分離與兩重熒光定量PCR相結(jié)合的快速檢測方法對鮮豬肉中金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行檢測分析，檢測可在6 h內(nèi)完成，金黃色葡萄球菌的檢測限為2.52CFU/g，志賀氏菌的檢測限為1.36 CFU/g。楊滴等[37]采用熒光定量PCR技術的TaqMan探針法對肉制品中蠟樣芽胞桿菌進行分析檢測，最低檢出限為1 ×103CFU/mL，同時具有較高的特異性和靈敏度。王遠洋等[40]對釀膿鏈球菌進行熒光定量PCR檢測分析，為食品中釀膿鏈球菌的檢測提供了靈敏度高、特異性強、高效便捷的參考方法。

3.1.2 水產(chǎn)品中食源性致病菌的檢測 水產(chǎn)品的食品安全性常常會因糞便或生活廢水等污染而受到影響，除此之外，在加工、貯藏、運輸、銷售等各個環(huán)節(jié)的操作不當或衛(wèi)生要求不達標，水產(chǎn)品也有可能會被致病菌污染。吳孟娟[41]利用免疫磁珠捕獲與熒光定量PCR聯(lián)合技術建立對水產(chǎn)品中河弧菌的快速檢測方法。Miotto等[27]建立了用PMA與熒光定量PCR聯(lián)合的方法檢測牡蠣中存活的大腸桿菌。

表1 熒光定量PCR在食源性致病菌檢測中的應用情況Table 1 Application of real-time qPCR in the detection of food-borne pathogens

3.1.3 乳制品中食源性致病菌的檢測 乳制品營養(yǎng)豐富并且容易被人體消化吸收，因此也存在被致病菌污染風險[42]。不僅養(yǎng)殖環(huán)境、母體本身會對乳制品中的致病菌數(shù)量產(chǎn)生影響，在工人擠奶操作和生產(chǎn)加工的過程中滅菌是否徹底以及儲運銷售過程中交叉污染等均會對乳制品的食品安全性造成影響。Demirci等[30]應用熒光定量PCR技術對來自48頭奶牛、65只山羊、65只綿羊和53頭驢的231份生乳樣品中的沙門氏菌和志賀氏菌進行了研究。林碧蓮等[32]建立了多重實時熒光定量PCR快速檢測嬰幼兒奶粉中的沙門氏菌、克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌的方法，姚笛等[34]利用熒光定量PCR檢測方法對牛乳中的沙門氏菌進行檢測。郭夢冉等[36]建立了熒光定量PCR對乳制品中金黃色葡萄球菌檢測的方法，通過實驗驗證檢出限為3.5 CFU/mL，并且可以快速檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌。

3.1.4 即食食品中食源性致病菌的檢測 即食食品容易在加工或貯藏運輸?shù)倪^程中被致病菌侵染從而威脅到消費者的身體健康，其中單增李斯特菌的侵染非常普遍。據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，我國即食食品被單增李斯特菌侵染的比率為1%～6%[43]。鮮切果蔬作為即食食品更容易被致病菌污染，鮮切果蔬中常見的食源性致病菌包括大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏桿菌屬等[44]。關棣鍇等[22]對超市中售賣的鮮切伊麗莎白甜瓜中的單增李斯特菌進行熒光定量PCR檢測，其檢出限為6.28×102CFU/mL。葉欣[45]對即食肉制品和果蔬中的金黃色葡萄球菌進行熒光定量PCR檢測，避免了細胞培養(yǎng)的過程，大大提高了檢測速度和效率。郭薔等[46]建立了一種可以快速檢測蔬菜中沙門氏菌的熒光定量PCR的方法，檢出限為18 CFU/mL，準確率高達90%，應用該方法對從農(nóng)貿(mào)市場獲取的60份新鮮蔬菜樣品進行檢測，結(jié)果表明其中5份樣品含有沙門氏菌，檢出率為8.33%。

標準培養(yǎng)方法、常規(guī)PCR和熒光定量PCR在食源性致病菌檢測中的應用比較見表2。標準培養(yǎng)檢測方法需要劃線培養(yǎng)、染色鏡檢、平板計數(shù)等，步驟繁瑣，耗時較長，但是操作簡單，成本低，不需要特殊儀器，也不需要專門培訓專業(yè)技術人員。常規(guī)PCR比標準培養(yǎng)檢測方法速度更快，靈敏度更高，需要PCR儀和凝膠電泳，成本較高，速度較快，但是提取DNA時無法判斷菌體是否死亡，還有可能提取的過程中會被抑制PCR進程的物質(zhì)污染，或者發(fā)生提取不完全等情況，均可能對檢測結(jié)果造成誤差。熒光定量PCR比常規(guī)PCR更敏感、更準確，并且反應環(huán)境相對封閉，減少了被污染的可能性，不需要凝膠電泳，操作步驟相對較少，檢測時間短、速度快，但是需要培訓專業(yè)技術人員，而且熒光定量PCR儀和探針價格較貴，檢測成本高。

3.2 食品摻雜摻假的檢測

3.2.1 肉制品中摻雜摻假的檢測 近年來有學者應用熒光定量PCR技術對肉制品的摻雜摻假作了研究。Chen等[50]在線粒體細胞色素b基因片段中設計了物種特異性引物和探針，建立了定量檢測肉制品中牛源性成分的熒光定量PCR方法，結(jié)果表明該引物和探針對肉制品中的牛源性成分具有特異性，絕對檢出限為0.025 ng DNA，陽性樣品相對檢出限為0.002%（w/w），該方法在實際應用中具有良好的穩(wěn)定性、特異性和敏感性。Tan等[51]建立了一種優(yōu)化的DNA提取方法與SYBR Green染料熒光定量PCR結(jié)合的檢測試劑盒，用于快速檢測肉制品中的豬源性成分，在DNA混合物中檢出限為10 fg豬源性DNA和0.001%（w/w）豬源性DNA，該方法可以在1.5 h內(nèi)完成檢測，而且與探針法相比成本低4倍。Kim等[52]用線粒體細胞色素b基因設計了驢源性特異性引物和探針，建立了熒光定量PCR檢測不同肉制品中驢源性成分的方法，檢測限為0.001 ng DNA，在生、煮、烤、烘干、研磨、油炸和高壓滅菌的肉制品中的檢測限為0.001%。Li等[53]提出了一種基于參考引物的熒光定量PCR方法，用于定量測定山羊肉中摻雜的豬源性成分，對不同比例的豬和山羊肉混合物進行檢測，結(jié)果顯示該方法的準確度較高、耗時短、操作簡便。

表2 標準培養(yǎng)方法、常規(guī)PCR與熒光定量PCR比較Table 2 Comparison of standard culture method, conventional PCR and real-time qPCR

3.2.2 乳制品中摻雜摻假的檢測 馬奶酒（酸馬奶）傳統(tǒng)上是由馬乳自發(fā)發(fā)酵而成，生產(chǎn)者和交易者存在將馬制品與牛制品摻假的可能性。Guo等[54]建立了基于物種特異性的TaqMan探針三重熒光定量PCR的方法，用于鑒定牛乳和乳制品中的牛源性物質(zhì)和馬源性物質(zhì)，同時擴增了內(nèi)源性對照，以消除假陰性的可能，該方法檢測牛乳、酸牛乳和馬乳檢出限為0.001 ng，酸湯和馬奶酒檢出限為0.005 ng，此外，使用不同源性乳品混合物有效驗證了該方法良好的特異性、敏感性和可重復性。Domenico等[55]開發(fā)了一種TaqMan探針的熒光定量PCR快速測定方法，可用于乳制品中的物種鑒定，該方法被證明對牛、綿羊、水牛和山羊源性物質(zhì)具有敏感性、快速性和特異性。

3.2.3 飲料中摻雜摻假的檢測 藍莓、樹莓、蔓越莓等小漿果不僅口感好、能量低而且含有豐富的有益健康的生物活性物質(zhì)，因此受到廣大消費者的青睞。Yang等[56]建立了一種基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法，用于鑒別小漿果產(chǎn)品中蔓越莓、覆盆子和藍莓的原料成分，并對經(jīng)過巴氏殺菌以及高溫高壓處理的小漿果產(chǎn)品進行了測試，驗證了其適用性。將該方法用于對小漿果產(chǎn)品摻雜摻假的檢測，可確定小漿果產(chǎn)品的真實性，避免消費者受欺詐，同時預防食物過敏。

咖啡粉和速溶咖啡中常常會有摻入各種價格便宜谷物的情況，如烤大麥、玉米、大豆等，因此，需要對磨碎的咖啡豆和速溶咖啡進行摻雜摻假的鑒別。Ferreira等[57]開發(fā)了一種基于熒光定量PCR的方法，用于檢測商用磨碎和速溶咖啡中的谷物，對大麥、玉米和大米源性物質(zhì)的檢出限分別為0.6、14和16 pg。通過對不同國家地區(qū)的30個咖啡商品進行檢測，驗證了該方法的適用性。

3.2.4 其他食品中摻雜摻假的檢測 藏紅花是印度、西班牙、法國等地區(qū)常用的一種調(diào)味料，其生產(chǎn)和收獲的成本很高。Villa等[58]提出了基于Eva Green染料的熒光定量PCR方法檢測藏紅花中摻雜的紅花，檢測限為2 pg的紅花DNA。

冬蟲夏草被描述為草藥“蟲草”中藥用成分的唯一來源，而蛹蟲草和天牛兩種真菌是食品成分的真菌來源。這三種植物的相互替代和摻雜摻假，嚴重影響了食品的安全性，降低了草藥的治療效果。Moon等[59]建立了一種熒光定量PCR檢測鑒別食品和草藥中真正的蟲草和摻假物種摻假程度的方法。

3.3 轉(zhuǎn)基因食品的檢測

轉(zhuǎn)基因食品是指可以直接食用的轉(zhuǎn)基因生物或者采用轉(zhuǎn)基因生物加工而成的食品，是最早應用熒光定量PCR技術進行檢測的一個食品領域。1999年，熒光定量PCR技術首次應用于食品中轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的檢測，為日后該技術在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應用提供了參考[7]。王鳳軍等[60]采用多重熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品進行檢測，該方法可同時檢測內(nèi)源基因和外源基因，提高了效率，降低了成本，實現(xiàn)了一管多檢，為轉(zhuǎn)基因大豆及其制品提供了便捷高效的檢測方法。權永兵等[61]采用熒光定量PCR分別對5種不同方法提取的大米Bt63轉(zhuǎn)基因成分進行檢測。王洪健等[62]建立了熒光定量PCR檢測蛋白粉中轉(zhuǎn)基因成分的方法。邵彪等[63]以啟動子、終止子和標記基因特異性序列為檢測目標，對肉制品中添加的植源性轉(zhuǎn)基因成分進行多重熒光定量PCR檢測，解決了DNA在加工過程中遭到破壞而產(chǎn)生假陰性的問題，同時使檢測更加方便快捷。

3.4 食品中過敏原的檢測

食品中的八大過敏原包括乳品、蛋類、花生、小麥、大豆、堅果、魚類和甲殼類，近年來，采用熒光定量PCR對多種過敏原進行了檢測（表3）。Guan等[64]用基于TaqMan探針的熒光定量PCR技術對牛奶中過敏原α-乳清蛋白進行分析檢測，檢測限為0.05 ng，可以在3 h內(nèi)完成DNA的提取和檢測，與依賴于蛋白質(zhì)檢測的方法相比，該技術具有更大的熱穩(wěn)定性和更強的分析加工食品的能力，并且更便宜、快捷和靈敏。Linacero等[65]在過敏原編碼序列上設計新型引物，利用熒光定量PCR方法檢測食品中的核桃過敏原，檢測限為2.5 pg核桃DNA，與ELISA分析比較，該方法在核桃的痕量檢測中顯示出更高的靈敏度和可靠性。

表3 熒光定量PCR在過敏原檢測中的應用Table 3 Application of real-time qPCR in the detection of allergens

3.5 食源性寄生蟲的檢測

環(huán)孢子蟲是一種原生動物寄生蟲，食用被其卵囊污染的新鮮果蔬產(chǎn)品或水會引起人類腹瀉病。Murphy等[78]開發(fā)了一種優(yōu)化的TaqMan探針熒光定量PCR測定法，并通過該方法和巢式PCR分別對香菜和覆盆子進行檢測，兩種方法經(jīng)過對比表明，熒光定量PCR工作量較小，操作簡單快捷，不易受擴增產(chǎn)物的污染，并且可以對擴增和結(jié)果進行實時監(jiān)控分析。Temesgen等[79]開發(fā)并評估了一種新穎的多重熒光定量PCR，用于同時檢測漿果中的多房棘球絳蟲、剛地弓形蟲和環(huán)孢子蟲，該檢測方法不但可以分析漿果水果，也可以很好地用于其他類型的新鮮農(nóng)產(chǎn)品的檢測。Frey等[80]建立了一種熒光定量PCR與熔解曲線分析相結(jié)合的新型檢測技術用于分離、檢測和區(qū)分葉類蔬菜和漿果中的絳蟲蟲卵，可用于監(jiān)測含有絳蟲的產(chǎn)品污染情況，以評估消費者的潛在風險。

3.6 可食用昆蟲的檢測

食用昆蟲的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)元素等含量豐富，具有營養(yǎng)價值高的優(yōu)點，但不是所有昆蟲都是安全可食用的。Kim等[81]開發(fā)了基于TaqMan探針的熒光定量PCR快速檢測方法，可在40 min內(nèi)完成對食品中可食用稻蝗的檢測，絕對檢出限為0.5 pg稻蝗DNA，在經(jīng)過處理的昆蟲混合物中檢出限為0.1%，該方法是一種高度特異、靈敏且快速的方法，為鑒別可食用稻蝗和加工食品中的稻蝗源性成分提供了參考?？墒秤眯Q常常會被加工成粉末狀，為了避免與其他昆蟲混淆，Kim等[82]使用TaqMan探針的熒光定量PCR方法檢測可食用家蠶，檢測限為0.001 ng蠶DNA，為向消費者提供準確的食品標簽信息提供了方法。

昆蟲是目前的新興食品來源，其可能攜帶對人類的身體健康存在一定風險的抗生素耐藥基因，在食品安全方面尚需對其抗生素耐藥性進行定量評估。Vandeweyer等[83]對熒光定量PCR進行了優(yōu)化，用以檢測和量化食用昆蟲中的抗生素抗性基因tet（O，K，M，S）和erm（B），并利用該技術檢測不同生產(chǎn)和飼養(yǎng)批次的30個新鮮昆蟲樣品，結(jié)果表明，粉蟲比蟋蟀樣品平均含有更多的tet（K）、tet（M）和tet（S）基因，僅在蟋蟀樣品中存在tet（O）基因，一個粉蟲樣品中還檢測到erm（B）基因。Milanovi?等[84]用熒光定量PCR技術對即食蝗蟲和粉蟲中的5種碳青霉烯抗 性 基 因（blaNDM-1、blaVIM、blaGES、blaOXA-48、blaKPC）進行了定量分析，結(jié)果表明，粉蟲樣本中沒有檢出blaGES、blaKPC和blaVIM基因，蝗蟲樣本中沒有檢測到blaGES和blaKPC基因，但blaOXA-48在樣本中普遍存在。

4 結(jié)論與展望

近年來，隨著科技的發(fā)展和檢測的需要，熒光定量PCR技術在很多領域的檢測方面具有很重要的作用和意義。熒光定量PCR技術屬于分子生物學檢測技術中的一種，憑借高自動化、被污染率小、靈敏、高效、快捷等特點，在快速檢測食品的致病菌、摻雜摻假、轉(zhuǎn)基因、過敏原等方面已取得大量的研究進展。然而熒光定量PCR技術還存在一些不足，比如：a.設備成本高；b.檢測所需的引物和探針價格較高；c.需要培訓專業(yè)技術人員來操作；d.樣品中可能存在抑制PCR進程的物質(zhì)；e.某些染料可能會與體系中非特異性DNA結(jié)合。但是熒光定量PCR技術在快速檢測領域仍具有很大優(yōu)勢。與酶聯(lián)免疫法相比，其在痕量檢測時具有更高的靈敏度和可靠性，而且外部環(huán)境對酶聯(lián)免疫檢測有一定影響，還有發(fā)生交叉反應的可能；與生物傳感器相比，生物傳感器雖然操作簡單易于攜帶，但是檢測成本高，抗體的純化和修飾也比較困難；環(huán)介導等溫擴增反應靈敏、專一、步驟少，可減少樣品損耗，但是對實驗的環(huán)境條件要求很高，容易產(chǎn)生假陽性；與依賴于蛋白質(zhì)檢測的方法相比，熒光定量PCR具有更大的熱穩(wěn)定性和更強的分析加工食品的能力。

熒光定量PCR技術在食品快速檢測領域發(fā)展迅速，將其與其他技術相結(jié)合是目前一大發(fā)展方向，比如：a.PMA與熒光定量PCR相結(jié)合，適量的PMA可以抑制死細胞DNA擴增，從而避免提取到死細胞的DNA而造成的假陽性；b.免疫磁珠法與熒光定量PCR相結(jié)合，免疫磁珠可以高特異性富集目標菌，從而提高檢測的效率和準確性；c.芯片與熒光定量PCR相結(jié)合，簡化實驗操作，使檢測時間更短[11]；d.自動化檢測體系與熒光定量PCR相結(jié)合，減少實驗員操作，避免檢測過程中的微生物污染[12]。未來可在現(xiàn)有研究基礎上，優(yōu)化設計引物和探針的操作、降低檢測成本，擴大使用范圍，解決導致檢測結(jié)果假陽性的問題。此外，開發(fā)便于攜帶和操作的試劑盒產(chǎn)品，使檢測不僅限于實驗室中，而可以隨時隨地進行，提高檢測的時效性和便利性，使熒光定量PCR技術擁有更大發(fā)展空間。