碭山酥梨膜結(jié)合態(tài)與可溶態(tài)多酚氧化酶性質(zhì)比較

胡月恒，劉 芳

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）

果蔬中的褐變以多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）引起的酶促褐變反應(yīng)最為明顯[1-4]。PPO在細(xì)胞內(nèi)有兩種存在形式：可溶態(tài)（sPPO）和膜結(jié)合態(tài)（mPPO）[5]。正常情況下，sPPO以可溶的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，mPPO結(jié)合在質(zhì)體、線(xiàn)粒體、葉綠體等細(xì)胞器膜和細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上[6]，PPO基因在細(xì)胞質(zhì)中合成含有轉(zhuǎn)運(yùn)肽的前體肽，分子質(zhì)量一般為60～75 ku，隨后前體肽被轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體的內(nèi)囊體膜上，即為mPPO。mPPO被分解成分子質(zhì)量約為45～69 ku的成熟肽，即為sPPO。在貯藏初期，果實(shí)的PPO主要以mPPO形式存在，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞以后，mPPO便從細(xì)胞膜上脫離，并向sPPO轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)PPO的催化活性[7]。或在某些外界刺激下，如鮮切處理、超高壓處理梨汁及非濃縮還原果汁時(shí)，其活性受到激發(fā)，表現(xiàn)出高活性[8]。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，PPO褐變機(jī)制研究逐步向分子水平深入[9-11]。但mPPO在褐變中的作用及其激活機(jī)制尚不明確。前期對(duì)sPPO性質(zhì)研究較多[12]，而碭山酥梨mPPO的研究暫時(shí)空白。

碭山酥梨屬于白梨系統(tǒng)，是我國(guó)果品中的名優(yōu)產(chǎn)品。該品種以果大、核小、黃亮、形美、皮薄、多汁、果肉細(xì)膩、甘甜酥脆等特點(diǎn)馳名中外，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者青睞，是我國(guó)出口創(chuàng)匯的主要梨品種之一[13-14]。但碭山酥梨采后的生理病害—黑皮病，嚴(yán)重影響它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。且鮮切處理、超高壓處理梨汁及非濃縮還原果汁時(shí)，多酚氧化酶活性出現(xiàn)上升，是由于sPPO結(jié)構(gòu)變化還是因?yàn)閙PPO被激活，具體原因尚不明確。本文以碭山酥梨為原料，采用超聲處理結(jié)合溫度誘導(dǎo)的方法提取mPPO，對(duì)mPPO的性質(zhì)進(jìn)行研究，并與sPPO催化特性進(jìn)行比較，為mPPO在碭山酥梨褐變中的作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為其加工過(guò)程中褐變控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碭山酥梨 購(gòu)自陜西楊凌，挑選形狀規(guī)則、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)綠變、大小均勻的酥梨為實(shí)驗(yàn)材料，洗凈，4 ℃貯藏；Triton X-100、PMSF、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白 北京索萊寶生物科技有限公司；鄰苯二酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris、HCl、檸檬酸、醋酸、磷酸 北京金銳林生物科技有限公司。

FE20-KpH計(jì) 梅特勒-托利多公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6 spectrophotometer） 北京普析通用儀器有限公司；HW.SY11-K電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；DW-HL328低溫冰箱 北京中科美菱公司；CI7600色度儀 愛(ài)色麗（上海）色彩科技有限公司；TGL 16-C高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碭山酥梨mPPO分離提取 碭山酥梨mPPO提取方法參考Bravo等[1]以及劉芳[12]的mPPO提取方法略有修改。將碭山酥梨洗凈、切塊，分別加入0.05 mol/L的4 ℃預(yù)冷PBS緩沖溶液（pH6.80、含2% PVPP，PMSF），料液比為體積比1:1，攪打30 s后離心15 min（11000 r/min），所得濾液棄去。濾渣加入150 mL Tris-HCl緩沖液（含0.25% Triton X-100）勻漿30 s，60 W超聲處理10 min后靜置30 min。4 ℃下11000 r/min離心15 min后，置于冰箱30 min，然后35 ℃水浴保溫15 min。25 ℃下離心15 min，上清液即為mPPO粗提液。mPPO粗提液進(jìn)行60%～80%硫酸銨分級(jí)沉淀，收集沉淀，用0.05 mol/L PBS緩沖液溶解透析24 h（4 ℃）。透析結(jié)束后，離心20 min（9000 r/min，4 ℃），收集上清液經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow層析0.1 mol/L NaCl梯度洗脫，將所得mPPO酶活高的組分收集備用。

1.2.2 碭山酥梨sPPO分離提取 碭山酥梨sPPO提取方法參考劉芳[12]中sPPO提取方法。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用Bradford法[15]進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。以牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：Y=0.0055X - 0.0048（R2=0.999）。

1.2.4 酶活測(cè)定 以鄰苯二酚為反應(yīng)底物，將0.5 mL酶液和2.5 mL的鄰苯二酚底物溶液混合，在25 ℃下用分光光度計(jì)測(cè)定混合液在1 min內(nèi)在特征吸收波長(zhǎng)下的吸光值的變化。一個(gè)酶活力單位（IU）為在測(cè)定條件下1 s內(nèi)吸光值的改變。酶的比活力為酶活與酶液蛋白含量的比值。

1.2.5 米氏常數(shù)測(cè)定 分別配制濃度為0.00625、0.0125、0.0250、0.0500、0.100和0.150 mol/L的鄰苯二酚溶液。測(cè)定不同底物濃度下mPPO的活性。參照Lineweaver-Burk作圖法，繪出的直線(xiàn)，縱坐標(biāo)值即為1/Vmax，橫截距即為1/Km，即Km=-1/X。

1.2.6 最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定 配制0.05mol/L的醋酸鈉緩沖溶液（pH3.50、pH4.00、pH4.50、pH5.00、pH5.50），0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH6.00、pH6.50、pH7.00、pH7.50），0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.00、pH8.50）。

最適反應(yīng)pH：用不同pH的緩沖液配制濃度為0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液。按照1.2.4酶活測(cè)定方法測(cè)定在不同pH條件下mPPO和sPPO的活性，計(jì)算比活力。

酸堿穩(wěn)定性：將酶液與不同pH緩沖液按體積比1:4混合，24 h后，測(cè)定mPPO和sPPO活性。以磷酸緩沖液（0.05 mmol/L，pH6.80）中酶液的活性為原始活性，并計(jì)算不同pH緩沖液下mPPO和sPPO活性與原始酶活的百分比，做為相對(duì)活性。

1.2.7 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定 用緩沖溶液(0.05 mol/L，pH6.80)配制0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液，分別置于溫度為25～85 ℃（每個(gè)處理間隔10 ℃）水浴槽中預(yù)熱。在未添加mPPO之前，先在各設(shè)定溫度下預(yù)熱15 min，然后迅速加入酶液，混勻。按照1.2.4酶活測(cè)定方法分別測(cè)定各溫度下的mPPO和sPPO活性，計(jì)算比活力。

1.2.8 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 將mPPO酶液置于溫度為25～75 ℃（每個(gè)處理間隔10 ℃）的水槽中，分別水浴10、20、30、40、50、60 min后，測(cè)定不同溫度下mPPO和sPPO的活性。

1.2.9 熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算 碭山酥梨sPPO及mPPO熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法參考Ioni??等[16]中的計(jì)算方法。失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算公式如式（1）～式（5）所示。

式中，A代表酶活；A0代表初始酶活；k為熱失活速率（min-1）；D為指數(shù)遞減時(shí)間（min），即在設(shè)定的溫度下，酶活降低90%所需要的時(shí)間；ZT表示D值對(duì)溫度的敏感性（℃），即D值變化一個(gè)對(duì)數(shù)時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度的變化；T為絕對(duì)溫度（K）；t1/2是失活半衰期（min）；Ea失活活化能（kJ/mol）；R為常數(shù)8.314（J/mol/K）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（meana±SD）表示。采用鄧肯式多重差異比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 比活力比較

酶的比活力為酶活與酶液蛋白含量的比值。mPPO與sPPO比活力結(jié)果如表1所示。從表1中可看出，當(dāng)以鄰苯二酚為底物時(shí)，碭山酥梨sPPO酶活高于mPPO。這與Webb等[17]研究結(jié)果一致。果蔬中存在不同的PPO亞型，且PPO在不同條件下表達(dá)量不同，所以不同果蔬中mPPO與sPPO的比活力差異很大。Tsurutani等[18]發(fā)現(xiàn)某些蘋(píng)果品種sPPO活性明顯高于其他蘋(píng)果品種中的潛伏態(tài)PPO。Sellés-Marchart等[19]發(fā)現(xiàn)以綠原酸為底物時(shí)，mPPO活性比sPPO更高。

表1 碭山酥梨sPPO和mPPO比活力比較Table 1 The specific activity of sPPO and mPPO from Dangshan pear fruit

2.2 米氏常數(shù)比較

米氏常數(shù)結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on reaction rate

圖2 底物濃度與反應(yīng)速率倒數(shù)圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot

當(dāng)以鄰苯二酚為底物時(shí)，計(jì)算可得Km(sPPO)為0.062 mol/L，Km(mPPO)為0.023 mol/L。這與其他果蔬中以鄰苯二酚為底物時(shí)的Km值研究結(jié)果一致，比如葡萄PPO（Km=52.6 mmol/L），杏PPO（Km=61 mmol/L）[20]。Km可表示酶對(duì)底物親和力的大小，從二者的Km值可看出，mPPO對(duì)鄰苯二酚的親和力更強(qiáng)，更易催化底物發(fā)生褐變。

2.3 最適反應(yīng)pH比較

sPPO與mPPO最適反應(yīng)pH如圖3所示。sPPO在pH5.00出現(xiàn)酶活高峰，而當(dāng)pH為4.50時(shí)，mPPO活性最高，明顯高于其他pH時(shí)的酶活。mPPO在pH7.00時(shí)有一個(gè)酶活小峰，這可能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，有研究表明富士蘋(píng)果mPPO在其結(jié)構(gòu)中存在一段未知功能區(qū)域，但其功能尚未明確[12]。在以往研究文獻(xiàn)中，也有類(lèi)似結(jié)果。George等[21]研究發(fā)現(xiàn)以鄰苯二酚為底物時(shí)，鱷梨最適pH為5.0和7.0，這與本研究結(jié)果一致。文獻(xiàn)報(bào)道中果蔬最適pH大多處于4.0～8.0之間[22]。這可能與底物、酶的活性中心、酶與底物形成的復(fù)合物存在不同的電離狀態(tài)等有關(guān)[23]。

2.4 酸堿穩(wěn)定性比較

碭山酥梨mPPO與sPPO的酸堿穩(wěn)定性如圖4所示。從圖4中可看出，mPPO酸堿穩(wěn)定性較好，在pH3.50～4.50時(shí)，24 h后酶活高于原酶活，其中在pH4.50時(shí)，24 h后酶活為原酶活的375.40%。這可能是由于在此區(qū)間內(nèi)mPPO構(gòu)象變化，活性中心暴露，更易與底物結(jié)合。在pH6.5時(shí)，24 h后mPPO酶活為原酶活的90.08%。pH6.50～7.50時(shí)，sPPO酶活穩(wěn)定性較好，其中pH7.0，24 h后酶活最高，為原酶活的45.33%。與sPPO相比較，mPPO酸堿穩(wěn)定性較高，這可能與其生理功能相關(guān)，但mPPO在果蔬采后生理中的作用及機(jī)制尚無(wú)深入研究。對(duì)mPPO在果蔬采后生理中的作用及機(jī)制研究有助于揭示果蔬采后貯藏保鮮及鮮切果蔬加工過(guò)程中的褐變機(jī)理，這將是mPPO今后的研究熱點(diǎn)。

圖3 pH對(duì)碭山酥梨mPPO及sPPO比活力的影響Fig.3 Effects of pH on the specific activity of mPPO and sPPO from Dangshan pear fruit

圖4 pH對(duì)碭山酥梨mPPO及sPPO穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of pH on the stability of mPPO and sPPO from Dangshan pear fruit

2.5 最適反應(yīng)溫度比較

最適反應(yīng)溫度測(cè)定結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，mPPO最適溫度高于sPPO。當(dāng)溫度為35～45 ℃時(shí)，mPPO活性最高。在45～55 ℃區(qū)間內(nèi)，酶活下降稍為緩慢，當(dāng)溫度超過(guò)達(dá)到55 ℃后，酶活迅速下降。當(dāng)溫度達(dá)到85 ℃時(shí)，酶活性接近為零。sPPO在35 ℃的活性最高。隨著溫度的升高，sPPO活性下降迅速。果蔬PPO最適溫度呈現(xiàn)很大差異，這不僅與其來(lái)源相關(guān)，與其在果蔬中的存在形式及狀態(tài)也密切相關(guān)。比如蛇皮果mPPO最適溫度為30 ℃[24]，枇杷果實(shí)潛伏態(tài)PPO最適溫度為70 ℃[19]，這與PPO在果蔬中參與抵御外界傷害的功能有關(guān)。

圖5 溫度對(duì)碭山酥梨mPPO及sPPO比活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the specific activity of mPPO and sPPO from Dangshan pear fruit

2.6 溫度穩(wěn)定性比較

sPPO及mPPO 溫度穩(wěn)定性及失活速率曲線(xiàn)如圖6、圖7所示。從圖6（a）可以看出，sPPO在25、35 ℃水浴時(shí)活性下降不明顯，穩(wěn)定性較好。在45～65 ℃時(shí)殘余活性隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，熱穩(wěn)定性迅速下降。75 ℃水浴10 min時(shí)活性幾乎為零。從圖7(a)可以看出，當(dāng)加熱10 min時(shí)，mPPO活性隨溫度升高而升高，75 ℃加熱10 min后，mPPO活性顯著高于其他加熱溫度的酶活（P＜0.05）。當(dāng)溫度低于55 ℃時(shí)，mPPO熱穩(wěn)定性較好，超過(guò)55 ℃后酶活下降迅速。

圖6 碭山酥梨sPPO熱穩(wěn)定性（a）及失活速率（b）曲線(xiàn)Fig.6 Thermal stability (a) and thermal inactivation rate (b) of sPPO from Dangshan pear fruit

為了進(jìn)一步的研究sPPO及mPPO耐熱性的差異，實(shí)驗(yàn)比較了兩者的失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)。sPPO及mPPO在不同溫度下熱失活后，將酶活取對(duì)數(shù)，即ln（A/A0），并與失活時(shí)間t進(jìn)行線(xiàn)性擬合，確定其失活動(dòng)力學(xué)模型。由圖6（b）、圖7（b）可知，sPPO及mPPO失活時(shí)間t與殘留酶活的對(duì)數(shù)ln（A/A0）在各溫度下均呈線(xiàn)性關(guān)系（決定系數(shù)R2＞0.946），表明sPPO及mPPO活力受加熱溫度及時(shí)間的影響顯著，隨時(shí)間及溫度升高而快速失活。同時(shí)，表明碭山酥梨sPPO及mPPO的熱失活遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

圖7 碭山酥梨mPPO熱穩(wěn)定性（a）及失活速率（b）曲線(xiàn)Fig.7 Thermal stability (a) and thermal inactivation rate (b) of mPPO from Dangshan pear fruit

2.7 熱失活動(dòng)力學(xué)比較

圖6（b）、圖7（b）中線(xiàn)性回歸的斜率即為熱失活速率常數(shù)的相反數(shù)（-k）。在熱失活動(dòng)力學(xué)研究中，熱失活速率常數(shù)（k）、失活半衰期（t1/2）和失活活化能（Ea）是表征酶熱穩(wěn)定性的三個(gè)重要參數(shù)。不同溫度下的失活速率k和半衰期t1/2反映酶失活快慢。由表2可知，sPPO及mPPO的失活速率常數(shù)k均隨著加熱溫度升高而增大，表明溫度越高sPPO及mPPO失活速率越快。45～65 ℃區(qū)間內(nèi)sPPO的失活速率常數(shù)k比mPPO小，表明其失活速率低于mPPO。而75 ℃時(shí)，sPPO失活速率常數(shù)k比mPPO大，表明在75 ℃高溫時(shí)，sPPO失活速率高于mPPO。

表2 碭山酥梨mPPO及sPPO失活的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 2 Parameters of first-order kinetic model for Dangshan pear mPPO and sPPO inactivation

酶失活半衰期t1/2和D值也是表征酶熱失活速率的重要參數(shù)，sPPO及mPPO的半衰期t1/2和D值均隨著加熱溫度升高而減小，表明溫度越高，sPPO及mPPO失活速率越快。75 ℃時(shí)，sPPO半衰期t1/2和D值均比mPPO小，說(shuō)明在此溫度下mPPO失活速率低于sPPO。這可能與其生理生化功能相關(guān)。Iyido?an等[25]在Amasya蘋(píng)果中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)在80 ℃下具有高穩(wěn)定性的PPO亞型。前期研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果mPPO序列中有與熱激蛋白類(lèi)似片段[13]，具體作用及機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。熱失活活化能Ea反映酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)弱，在同樣的處理?xiàng)l件下，Ea值越高表示反應(yīng)對(duì)溫度的依賴(lài)性越大。ZT值是表征酶對(duì)溫度鈍化敏感性的指標(biāo)，ZT值越大，說(shuō)明該酶對(duì)溫度的耐受性越大。從表2可知，mPPO的Ea值為78.257 kJ·mol-1，sPPO的Ea值為106.560 kJ·mol-1，說(shuō)明sPPO活性對(duì)溫度的依賴(lài)性更大。mPPO鈍化的ZT值為27.933 ℃，sPPO的ZT值為20.408 ℃，表明mPPO的熱耐受性更高。

3 結(jié)論

碭山酥梨mPPO與sPPO酶促性質(zhì)差異明顯。以鄰苯二酚為底物時(shí)，mPPO對(duì)底物親和力比sPPO強(qiáng)，最易發(fā)生褐變。碭山酥梨mPPO酸堿穩(wěn)定性好于sPPO。mPPO在pH3.50～4.50殘余酶活大于100%，其中在pH4.50時(shí)，殘余酶活為原來(lái)酶活的375.40%。mPPO最適反應(yīng)溫度為35～45 ℃，且在高溫區(qū)間熱穩(wěn)定性高于sPPO，且75 ℃處理10 min后mPPO活性顯著上升（P＜0.05）。熱失活動(dòng)力學(xué)分析表明，相同溫度下mPPO更易發(fā)生酶促反應(yīng)，且其熱耐受性更高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mPPO與sPPO酶促產(chǎn)物相比，mPPO酶促產(chǎn)物不易發(fā)生交聯(lián)，呈淺黃色，而不會(huì)出現(xiàn)sPPO酶促產(chǎn)物的棕褐色，這也從側(cè)面表明mPPO不是褐變的主要形式，它主要參與果蔬采后及加工中生理防御，比如貯藏期及鮮切貨架期內(nèi)的抗逆性，這將是后期研究重點(diǎn)。