海藻酸鈉裂解酶酶活測定方法研究

鄭明亮，鄭諢龍，孟 春，王 航,

（1.光催化研究所，生物科學與工程學院，福州大學，福建福州 350116；2.福建省博凱科技有限公司，福建福州 350108）

海藻酸鈉又名褐藻膠，是一種天然的高分子多糖，是海帶、馬尾藻、巨藻等海藻細胞壁和細胞質的重要組成部分[1-2]。海藻酸鈉裂解酶可通過底物的非還原末端的β消去機制降解褐藻膠,將褐藻膠降解為褐藻寡糖[3]。褐藻寡糖是一種功能性低聚寡糖，褐藻膠寡糖由于其降解模式、G/M比、分子量和降解產(chǎn)物的空間構象不同使得褐藻膠寡糖具有多種生物活性[4-8]。褐藻寡糖可作為高效、環(huán)保的生物肥料代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學肥料[9]。褐藻膠寡糖在保健食品、醫(yī)學領域也有很廣泛的應用，其具有多種生理活性，如抗腫瘤、刺激細胞因子的產(chǎn)生、減輕炎癥、抗菌、抗氧化、調節(jié)血脂和糖類等[10-15]。某些特定的褐藻寡糖還可以提高巨噬細胞的活性，誘導單核白細胞生產(chǎn)細胞因子，促進腸道益生菌生長，加速表皮細胞的增長繁殖[16-17]。

目前，海藻酸鈉裂解酶的酶活力測定方法主要有硫代巴比妥酸法（TBA）[18]、紫外吸收法[19,20]、粘度法[21]和還原糖法[22]。上述方法中，硫代巴比妥酸法操作較為繁瑣，粘度法要求待測液體積較大，還原糖法需沸水浴加熱，而紫外吸收法是基于酶解產(chǎn)生的不飽和糖醛酸在230～240 nm處有吸收峰，這種方法靈敏且便捷，是目前褐藻膠裂解酶酶活力測定的主要方法[23]。常見的紫外吸收法測定海藻酸鈉裂解酶酶活力的測量體系各不相同，主要的問題在于海藻酸鈉底物濃度太低（質量濃度為0.2%～0.75%[4,24-25]），導致酶促反應并不能接近最大反應速率，且測量范圍窄。目前未見有對該酶測定精密度、靈敏度、檢測范圍等系統(tǒng)研究的報道。

酶活的本質是以最大反應速率來表征酶量，因而理想的酶活測定方法的核心就是使反應速度達到最大的反應體系和反應條件。本文以酶促反應動力學理論為指導，系統(tǒng)研究酶活測定的反應體系和反應條件，為建立準確、高效的海藻酸鈉裂解酶酶活測定方法標準提供數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

基因重組的畢赤酵母工程菌 本實驗室保存；海藻酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鋅 國藥集團化學試劑有限公司，分析純；氫氧化鈉、硫酸鎂、硫酸鈣、五水合硫酸銅、七水合硫酸亞鐵 西隴科學股份有限公司，分析純。

HH-4型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；EU2600型紫外分光光度計 上海昂拉儀器有限公司；XZ21K型高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；ZWY-2101C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈉裂解酶酶液的制備 將基因重組的畢赤酵母在搖瓶中活化，30 ℃培養(yǎng)24 h；以10%體積比轉接至發(fā)酵罐中，參考金虎等[26]的培養(yǎng)條件，誘導重組蛋白表達。發(fā)酵120 h后，4 ℃、1000 × g離心5 min，收集上清液即為海藻酸鈉裂解酶粗酶液。

1.2.2 海藻酸鈉裂解酶酶活測定方法 參考文獻方法[25,27]并加以調整。底物海藻酸鈉用0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH7.0）配制。300 μL底物加入50 μL稀釋20倍的酶液于一定溫度水浴保溫20 min后終止反應，樣品稀釋20倍后在235 nm下測定其吸光值。

酶活力單位的定義為：在上述反應體系和反應條件下，每分鐘水解使吸光度值增加1所用的酶量定義為一個酶活力單位U。

1.2.3 動力學因素的確定

1.2.3.1 底物濃度的確定 37 ℃、pH 7條件下測量0.7～22 g/L底物終濃度時酶的最大反應速率。并采用 Lineweaver-Burk法[28-29]以 1/V 對 1/［S0］作圖，計算動力學參數(shù) Km、Vm，確定最適海藻酸鈉底物配制濃度。

1.2.3.2 加酶量的確定 在300 μL、22 g/L的底物中加入50 μL 0～5 U的酶液。測定37 ℃、pH 7條件下的加酶量與OD值變化的關系，確定反應體系中合適的加酶量范圍。

1.2.3.3 酶促反應時長的確定 以22 g/L海藻酸鈉為底物，加酶量9 U/mL，pH 7，溫度37 ℃ 條件下，不同反應時間（5～45 min）取樣測量酶最大反應速率，確定最適的酶促反應時長。

1.2.3.4 酶促反應的終止方法 在酶促反應20 min后，將反應液放置0 ℃冰浴中60 min，以放置室溫（25 ℃）0、10、60 mim作為對照，在最適反應條件下測定酶的反應速率。

1.2.4 環(huán)境條件的優(yōu)化

1.2.4.1 海藻酸鈉裂解酶最適反應pH 以22 g/L海藻酸鈉為底物，加酶量9 U/mL，溫度37 ℃條件下測量酶在不同pH（5～10）緩沖體系下的反應速率，確定酶最適反應pH。

1.2.4.2 海藻酸鈉裂解酶最適反應溫度 以22 g/L海藻酸鈉為底物，加酶量9 U/mL，pH7條件下測量酶在不同溫度（20～50 ℃）下的反應速率，確定酶最適反應溫度。

1.2.4.3 金屬離子對海藻酸鈉裂解酶反應速率的影響 在22 g/L海藻酸鈉為底物的酶促反應體系中分別添加終濃度為1和5 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+7種金屬離子，以未添加金屬離子的酶促反應組作為對照組，測量pH 7、37 ℃條件下的酶相對反應速率。

1.2.4.4 傳質對酶活測定的影響 采用同一批酶液進行酶活測量，分別測量在最適條件下靜置反應和200 r/min搖床反應的酶濃度。

1.2.5 方法的準確性和精密性

1.2.5.1 底物移取的精密性試驗 本實驗提出兩種方法解決底物移取精密性較差的問題，方法1采用100 ℃水浴加熱海藻酸鈉底物5 min以降低粘度；方法2每個樣都使用新槍頭；對照組不加熱底物也不換槍頭。兩種方法及對照組分別稱重移液300 μL的22 g/L海藻酸鈉底物5次，計算兩種方法及對照組底物移取重量的平均值、標準偏差和相對標準偏差。

1.2.5.2 方法的精密性試驗 重復8次測試同一批酶液的酶濃度，計算平均值、標準偏差、相對標準偏差。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個實驗3次重復，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用 Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 動力學因素

2.1.1 底物濃度的確定 根據(jù)米氏方程，底物濃度S足夠大時，反應速度V0≈Vm=k2e0，不受底物濃度影響，而與酶濃度成正比，可用于表征酶量。在酶活測定反應體系中，底物濃度通常定為5～10 Km，因而需先測出酶的Km值。如圖1所示，采用 Lineweaver-Burk法測得Km值為3.17 g/L。

圖1 Lineweaver-Burk 法計算Km、VmFig.1 Lineweaver-Burk method to calculate Km, Vm

從動力學角度考慮，底物濃度越大，越有利于消除底物濃度對酶活測定的影響，但在實際操作中還要考慮底物的溶解度和黏度。海藻酸鈉是高分子量聚合物，溶解度小，黏度大，過高的濃度不容易配制，而且也不容易移取。綜合考量，底物濃度設為6 Km左右，通過計算，海藻酸鈉溶液濃度定為2.2%（W/V）。

2.1.2 加酶量的確定 米氏方程的前提假設之一是酶濃度遠小于底物濃度，同時過大的酶濃度會使底物濃度迅速下降，從而使反應速度降低。對于海藻酸鈉裂解酶而言，反應速度不僅受底物濃度影響，而且還受到海藻酸鈉分子量影響，分子量越小，反應速度越慢[30]。因此在酶活測定體系中，加入的酶量不宜太大，以保證反應速度與酶量成正比。

圖2 酶添加量對產(chǎn)物生成的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on product

由圖2可見，在加酶量小于1.5 U時，產(chǎn)物隨加酶量線性增加，加酶量超過1.5 U后，曲線斜率開始逐漸下降。因此酶活測定體系加酶量應小于1.5 U。

另一方面，加酶量也不能太小，否則由于分光光度計靈敏度的限制，在測定時間內無法測到OD235。為保證測量的有效數(shù)位，OD235讀數(shù)應在0.1以上，由此倒算，最小加酶量為0.12 U。因此反應體系發(fā)酵酶液上樣的濃度應稀釋至2.4～30 U/mL。

2.1.3 酶促反應時長的確定 不同反應時間下取樣測量酶的最大反應速率，結果如圖3所示。

圖3 酶促反應速率與反應時間的關系Fig.3 Relationship between enzymatic reaction rate and reaction time

隨著反應的進行，底物濃度不斷降低，酶不斷失活，因而反應速率越來越低，因此酶活測定的反應時間不能太長。另一方面，反應時間過短，則會導致檢測的靈敏度下降，同時還會導致測定誤差變大。為確定反應時間，本實驗測定了不同反應時間下的平均反應速度，結果如圖3所示，反應時間在20 min以內，平均反應速度幾乎不變，反應時間超過20 min后，反應速率開始明顯下降，表明反應時間不能超過20 min。同時也注意到，在反應時間2 min時測得的反應速度的誤差很大。因此，以2.2%海藻酸鈉底物測量海藻酸鈉裂解酶活性時，反應時間設為20 min較為合適。

2.1.4 酶促反應的終止方法 酶活的測定需要及時終止反應，現(xiàn)有的終止反應方法有高溫、加酸、加堿、冰浴等。其中，高溫終止反應方法操作繁瑣，加熱過程容易使EP管開蓋，造成樣品損失或污染。加酸、加堿的方法改變了反應液的體積，加液的誤差會影響最終測定的結果，而且當有較多樣品需要同時進行酶活測定時，難以保證同時終止。此外海藻酸鈉在高溫、酸、堿環(huán)境中也會水解，會造成測定結果偏大。冰浴的方法沒有上述缺點，但冰浴不能使酶失活，而只能使反應速率降低。如果冰浴能把反應速率降到足夠低，在較短時間內檢測不到產(chǎn)物變化，也可將冰浴做為終止反應的有效方法。

如圖4所示，37 ℃反應結束后，反應液在25 ℃下放置10 min就對測定結果有顯著影響（P＜0.05），而在冰浴中放置1 h，對酶活測定沒有影響。相比高溫、加酸、加堿的終止反應方法，冰浴終止酶解反應的方法有安全、易操作、效果好等優(yōu)點。

2.2 環(huán)境條件的影響

2.2.1 海藻酸鈉裂解酶最適反應pH 磷酸鈉緩沖液pH對海藻酸鈉裂解酶反應速率的影響如圖5所示。

圖4 冰浴終止酶解反應的效果Fig.4 The effect of ice bath to terminate the enzymatic hydrolysis reaction

結果表明，pH6.5～7.5時，海藻酸鈉裂解酶的酶促反應速率最大，有較寬的最適反應pH范圍。pH小于6或大于8時，酶反應速率明顯下降。這表明此時的水解pH已經(jīng)影響了海藻酸鈉裂解酶的活性，偏離海藻酸鈉裂解酶最適pH范圍的過酸或過堿的水解環(huán)境會導致其酶活逐漸喪失。酶活測定一般選擇在最適pH下測定，根據(jù)圖5結果，選擇測定pH7.0。

圖5 海藻酸鈉裂解酶在不同pH條件下的反應速率Fig.5 Reaction rate of sodium alginate lyase under different pH conditions

2.2.2 海藻酸鈉裂解酶最適反應溫度 溫度對海藻酸鈉裂解酶反應速率的影響如圖6所示。

圖6 海藻酸鈉裂解酶在不同溫度條件下的反應速率Fig.6 Reaction rate of sodium alginate lyase under different temperature conditions

溫度對于酶反應而言是把雙刃劍，提高溫度一方面可以增加分子碰撞幾率，從而提高反應速度，另一方面會加快酶失活，從而降低反應速度。圖6結果表明，在我們的測定條件下，最適反應溫度范圍為37～46 ℃，我們選定常用的37 ℃為測定溫度。

2.2.3 金屬離子對海藻酸鈉裂解酶反應速率的影響金屬離子會顯著影響海藻酸鈉裂解酶活性[27]。添加適量的激活劑可提高酶活測定的靈敏度。為此考察了7種金屬離子對酶活性的影響。結果如圖7所示。

圖7 金屬離子對海藻酸鈉裂解酶酶反應速率的影響Fig.7 Effect of metal ions on the reaction rate of sodium alginate lyase

終濃度為1 mmol/L時，Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+對該酶具有一定程度的促進作用；Fe2+、Cu2+對該酶具有不同程度的抑制作用，F(xiàn)e2+抑制效果較為明顯。終濃度為5 mmol/L時，Na+、K+、Mg2+對該酶具有不同程度的促進作用，K+效果最好，相對反應速率達到114%；Ca2+、Fe2+、Cu2+對該酶具有不同程度的抑制作用，Cu2+抑制效果較為明顯。據(jù)韓偉等[31]報道， Cu2+對海藻酸鈉裂解酶有抑制作用，1 mmol/L Ca2+有一定促進作用，而5 mmol/L Ca2+反而對酶產(chǎn)生抑制作用，與本實驗結果一致。在酶活測定時，可在反應體系中添加5 mmol/L的K+以提高酶的最大反應速率。

2.2.4 傳質對酶活測定的影響 通常酶活測定體系較小，不受傳質影響，可在靜置條件下測定。然而本實驗所使用的海藻酸鈉濃度較高，黏度大，傳質可能會成為反應的限制性因素。為此分別考察了靜置和200 r/min振蕩條件對酶活測定的影響，結果如圖8所示。

結果表明，在2.2%海藻酸鈉底物反應條件下，靜置反應與200 r/min振蕩反應下的酶活力測量數(shù)值無顯著差異。這是由于反應體系體積很小，傳質影響小，因此靜置反應即可。

2.3 方法準確性與精密性

2.3.1 底物移取的精密性試驗 海藻酸鈉是一種常見的增稠劑，改進后的酶活測定方法將0.5%海藻酸鈉的底物改為2.2%，海藻酸鈉底物的黏度明顯提高，這會導致移液槍進樣量精密度變差。為了解決這個問題，本實驗提出兩個方案，一是將底物加熱到100 ℃以降低黏度，二是每個樣都使用新槍頭，測試結果如圖9所示。

圖8 傳質速度對酶活測定的影響Fig.8 Effect of mass transfer speed on enzyme activity determination

圖9 不同條件對底物移取的精密性影響Fig.9 The influence of different conditions on the precision of substrate removal

結果表明，沸水浴加熱降低底物粘度的方法有一定效果，底物移取的相對標準偏差由10.4%降為8.2%。而每加一個樣換一個槍頭的方法，底物移液誤差最小，效果最好，相對標準偏差小于2%。另外要注意的是，每個槍頭需要剪去前端一小節(jié)，增大橫截面積，以免底物堵塞槍頭。

2.3.2 精密性試驗 取同一批發(fā)酵液，采用改進后的方法重復測量海藻酸鈉裂解酶的酶活性8次，精密性試驗結果如表1所示。

表1 海藻酸鈉裂解酶酶活測定的精密度試驗（n=8）Table 1 Precision test for determination of enzyme activity of sodium alginate lyase (n=8)

由表1可知，用改進后的方法測量的8組平行海藻酸鈉裂解酶酶活力數(shù)值波動范圍較小，標準偏差為7.72 U/mL，相對標準偏差為4.54%，檢測結果精密度高，可見此方法可信，檢測結果有效。

3 結論

通過對影響酶活測定因素的系統(tǒng)研究，本文建立了海藻酸鈉裂解酶活力測定方法：300 μL底物溶液（海藻酸鈉2.2%，KCl 5 mmol/L，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH7.0）加入50 μL稀釋至2.4～30 U/mL的酶液，于37 ℃水浴靜置反應20 min后用冰浴終止反應，反應液稀釋20倍后在235 nm處測定吸光度。每份底物溶液均需用新槍頭移取以提高精密度。本方法相對標準偏差小于5%。該研究主要解決了傳統(tǒng)紫外吸收法測量酶活的海藻酸鈉底物濃度太低問題，并研究了提高底物濃度后帶來的一系列問題，為制訂海藻酸鈉裂解酶活性測定方法標準提供數(shù)據(jù)支撐。