響應(yīng)面法優(yōu)化超聲微波聯(lián)用輔助提取黑木耳黑色素工藝

宋丹靚敏，么宏偉，曾偉民，馮 磊，王 淼，程 文，萬 鵬，雷 虹,

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080；3.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江牡丹江 157011；4.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

黑木耳（Auricularia auricula-judae），又名光木耳。按照真菌學(xué)分類屬于擔(dān)子菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬[1]。我國是世界上主要的木耳生產(chǎn)國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的 60%以上，其產(chǎn)區(qū)遍布20多個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）[2]。作為一種營養(yǎng)豐富的食用菌，黑木耳具有多種保健作用。研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳黑色素具有抗氧化、抗輻射、抗病毒、提高免疫力等許多重要的生理功能，極具開發(fā)潛力[3]。同時，黑色素（Melanin）被認(rèn)為是黑色食品中最重要的功能成分之一[4]。黑色素是由吲哚或酚類化合物氧化聚合而成的非均質(zhì)高分子化合物，一般呈黑色、褐色或者棕色，廣泛存在于動植物和微生物中[5]。同時在食品加工、化妝品開發(fā)、疾病預(yù)防治療等方面也都有著廣闊的應(yīng)用前景[6]。

侯若琳等[7]采用正交法和響應(yīng)面法對纖維素酶-超聲波協(xié)同提取黑木耳黑色素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對最優(yōu)條件下提取的黑木耳黑色素體外抗氧化活性進(jìn)行了檢測。潘磊等[8]使用響應(yīng)面對超聲波輔助法提取黑木耳黑色素工藝進(jìn)行優(yōu)化。Harki等[9]用堿提酸沉法從真菌細(xì)胞中提取黑色素粗品，于7 mol/L的鹽酸中在100 ℃下水解2 h，離心，依次用0.01 mol/L的鹽酸和蒸餾水對色素沉淀進(jìn)行洗滌，最后用氯仿洗滌，即得純化的黑色素。李琦等[10]研究了黑木耳黑色素的提取純化和鑒定方法，運(yùn)用紫外-可見光譜掃描和傅里葉紅外光譜掃描的方法對黑木耳黑色素的基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素與酪氨酸合成黑色素表現(xiàn)出相對一致的紫外-可見光譜和傅里葉紅外光譜特征，最終將黑木耳黑色素歸類為3，4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)類黑色素。

超聲波-微波輔助提取（UMAE）是一種結(jié)合超聲波和微波方法的新工藝技術(shù),它充分利用了微波和超聲空化的高能效應(yīng)，克服了傳統(tǒng)超聲波和微波提取的缺點(diǎn)[11]。這種方法能夠快速、有效地在低溫環(huán)境條件下提取，節(jié)省能源和時間。并且，UMAE已被用于從植物中提取多種活性化合物，如番茄紅素、植物油、多糖和低聚糖[12]。然而，現(xiàn)階段使用超聲波-微波輔助提取法從黑木耳中提取黑色素的研究較為少見。

本文采用超聲-微波聯(lián)用輔助法提取木耳黑色素，在明確黑木耳黑色素最大吸收波長的前提下，研究黑木耳干粉粉碎粒度、超聲功率、微波功率、聯(lián)合作用時間對黑木耳黑色素吸光度的影響，使用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳黑色素提取工藝，并結(jié)合掃描電鏡檢測，與傳統(tǒng)溶劑法提取黑木耳黑色素方法進(jìn)行比較，最終明確超聲-微波聯(lián)用輔助提取法對黑木耳黑色素提取的優(yōu)勢所在，以期為黑木耳黑色素的進(jìn)一步開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳材料 由東寧黑木耳產(chǎn)業(yè)基地提供，菌種保藏號：HDXZ-1；氫氧化鈉、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氫鈉、三氯甲烷、檸檬酸 均為分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；鹽酸 分析純，哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸合成黑色素 標(biāo)準(zhǔn)品,購于Sigma公司。

FDV手提式小型高速粉碎機(jī) 北京環(huán)亞有限公司；SL-SM200超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng) 南京順流儀器有限公司；H2050R臺式高速大量冷凍離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV-2500島津紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；AB104-N電子天平 常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；PHS-25 pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；W201電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；S-4800掃描式電子顯微鏡 日本株式會社；冷凍干燥機(jī) 上海那艾精密儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳原料預(yù)處理 黑木耳原料為干制品，使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，將粉碎完成的黑木耳粉末依次過200、160、120、80、40 目篩，收集不同目數(shù)下黑木耳干粉并將其置于自封袋中，于干燥條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 傳統(tǒng)溶劑法提取黑木耳黑色素工藝 黑木耳干品經(jīng)粉碎后，過40目篩。準(zhǔn)確稱取黑木耳粉末樣品10.0 g，加入250 mL濃度為3 mol/L的鹽酸，70 ℃下攪拌浸提1 h，混合物經(jīng)4000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀，沉淀采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH至12，充分溶解攪拌后，再經(jīng)4000 r/min 離心15 min[13]。取上清0.5 mL，用蒸餾水稀釋180倍，于紫外分光光度計(jì)上測定其吸光度。其余上清液采用3 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，靜置10 min后，4000 r/min 離心15 min取沉淀，得到黑色素粗品。

1.2.3 超聲波輔助法提取黑木耳黑色素工藝 取粉碎后過40目篩黑木耳粉末10.0 g，按照料液比1:30 mL，加入0.1 mol/L NaOH溶液，超聲破壁處理（功率80 W，80 min），10000 r/min離心，15 min。取上清液0.5 mL用蒸餾水稀釋180倍，測定吸光度[14]。其余上清液采用3 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，靜置10 min，沸水浴酸沉10 h，10000 r/min 離心15 min取沉淀，即為黑色素粗品。

1.2.4 超聲-微波聯(lián)用輔助提取法提取黑木耳黑色素工藝 取黑木耳粉末10.0 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)提取液pH至12，使用超聲-微波聯(lián)用處理，10000 r/min離心，15 min，取上清0.5 mL用蒸餾水稀釋180倍，測定吸光度。其余上清液采用3 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，靜置10 min，沸水浴酸沉10 h，10000 r/min 離心15 min后，沉淀即為黑色素粗品。

1.2.5 黑木耳黑色素的純化 將所提取的黑木耳黑色素粗提物，先后采用氯仿、乙酸乙酯和乙醇洗滌，最后沉淀再用蒸餾水洗滌3 ～ 5次，最后一次離心，取固體，經(jīng)冷凍干燥即得黑色固體粉末狀的精制黑木耳黑色素。

1.2.6 最大吸收波長檢測 稱取少量已純化的黑木耳黑色素溶于pH為8的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液中，在40 ℃的條件下，在可控溫磁力攪拌器中攪拌溶解1 h，使色素盡可能溶解，溶液經(jīng)4000 r/min離心15 min，取上清液，使用石英比色皿在波長200 ～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜掃描[15]。

1.2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波聯(lián)用輔助提取黑木耳黑色素

1.2.7.1 超聲-微波聯(lián)用輔助提取黑木耳黑色素單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) a.黑木耳干粉最佳微粉碎粒度測定：使用電子天平稱取依次過40、80、120、160、200 目篩黑木耳干粉各10.0 g，在料液比1:30 g/mL，超聲功率400 W，微波功率200 W，聯(lián)合處理時間20 min條件下，考察不同粉碎顆粒粒度對于黑木耳黑色素提取的影響，將所得提取液離心，取0.5 mL上清液，用蒸餾水稀釋180倍，于207 nm波長處測定吸光度，以吸光度值大小明確黑木耳干粉最佳微粉碎粒度。b.黑木耳黑色素提取最佳超聲功率參數(shù)測定：用電子天平稱取過120目篩黑木耳干粉10.0 g，料液比1:30 g/mL，微波功率200 W，聯(lián)合作用時間20 min條件下，通過設(shè)置不同超聲功率：300、350、400、450、500 W，考察超聲功率對于黑木耳黑色素提取的影響，將所得提取液離心，取0.5 mL上清液，用蒸餾水稀釋180倍，于207 nm波長處測定吸光度，以吸光度值大小判定最佳超聲功率參數(shù)。c.黑木耳黑色素提取最佳微波功率參數(shù)測定：用電子天平稱取過120目篩黑木耳干粉10.0 g，料液比1:30 g/mL，超聲功率400 W，聯(lián)合作用時間20 min條件下，通過改變不同微波功率：100、200、300、400、500 W，考察微波功率對于黑木耳黑色素提取的影響，將所得提取液離心，取0.5 mL上清液，用蒸餾水稀釋180倍，于207 nm波長處測定吸光度，通過吸光度值大小明確最佳微波功率參數(shù)。d.黑木耳黑色素提取最佳超聲-微波聯(lián)合作用時間測定：用電子天平稱取過120目篩黑木耳干粉10.0 g，料液比1:30 g/mL，超聲功率400 W，微波功率400 W條件下，通過改變超聲-微波聯(lián)合作用時間分別為：10、20、30、40、50 min，考察超聲-微波聯(lián)合作用時間對于黑木耳黑色素提取的影響，將所得提取液離心，取0.5 mL上清液，用蒸餾水稀釋180倍，于207 nm波長處測定吸光度，以吸光度值大小明確超聲-微波聯(lián)合作用時間的最佳參數(shù)。

1.2.7.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素實(shí)驗(yàn)中首先確定出最佳黑木耳干粉粉碎粒度，在此基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析方法（表1），以吸光度為指標(biāo)，優(yōu)化超聲-微波聯(lián)用輔助法提取黑木耳黑色素的工藝參數(shù)。

表1 黑木耳黑色素提取 Box-Behnken 試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for A.auricula-judae melanin extraction

1.2.8 黑木耳黑色素提取得率的計(jì)算 W（%）=（W1/W2）×100

式中：W表示黑木耳黑色素粗提物得率，%；W1表示根據(jù)冷凍干燥稱重后的黑色素粗提物質(zhì)量，g；W2表示黑木耳微粉使用量，g。

1.2.9 不同提取方法處理黑木耳干粉形態(tài)分析 使用S-4800掃描電子顯微鏡（SEM）檢測未做提取處理黑木耳干粉樣品、傳統(tǒng)溶劑提取法處理后黑木耳干粉樣品、超聲波輔助提取法處理后黑木耳干粉樣品、超聲-微波聯(lián)用輔助提取法處理后黑木耳干粉樣品的形狀和表面特征。于高真空（1.3×10-3PA），1000×放大倍數(shù)，光源6.0，分辨率9.8 nm，12.5 kV加速電勢條件下，觀察每個樣品經(jīng)不同提取方法處理后的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件中One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用LSD法；P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

通過最大吸收波長可明確所提取得到的物質(zhì)是否為黑色素，亦可將不同提取方法處理后的黑木耳黑色素提取液于其最大吸收波長處進(jìn)行比較測定，可對不同提取工藝進(jìn)行比較分析，以明確最佳提取工藝參數(shù)，結(jié)果見圖1。

圖1 黑木耳黑色素的紫外掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum of A. auricula-judae melanin

由紫外-可見光譜掃描圖譜可見，酪氨酸合成黑色素的紫外掃描最大吸收峰值在紫外波長210 nm處，純化的黑木耳黑色素的最大吸收峰值在紫外波長207 nm處，在所設(shè)定的200～600 nm的紫外可-見光譜掃描范圍內(nèi)呈現(xiàn)出了與酪氨酸合成黑色素相對一致的紫外吸收變化規(guī)律，在紫外區(qū)具有強(qiáng)吸收，從最大吸收峰值處開始，隨著掃描波長的逐漸增大，吸光度呈現(xiàn)出下降的變化趨勢，具有典型的黑色素紫外吸收圖譜特征，這與Bell等[16]報(bào)道的不同來源黑色素的紫外可見光最大吸收峰值在波長在210 nm附近具有較高的一致性。

將經(jīng)不同提取工藝參數(shù)提取后的黑木耳黑色素提取液在波長207 nm處測定吸光度值，進(jìn)行比較分析，以此吸光度值為評價指標(biāo)，確定最佳黑木耳黑色素提取工藝參數(shù)條件。

2.2 超聲-微波聯(lián)用法提取黑木耳黑色素工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 黑木耳干粉最佳微粉碎粒度的確定 不同微粉碎粒度參數(shù)對黑木耳黑色素提取液吸光度值的影響結(jié)果如圖2所示?？芍?，黑木耳干粉微粉碎粒度由過40 目變化至120 目（380 μm變化至120 μm）過程中，隨著顆粒粒度的減小，黑木耳黑色素提取液的吸光度逐步增加，表明黑木耳干粉原料粉碎粒度在該范圍內(nèi)時，黑木耳黑色素提取液的吸光度值與微粉碎顆粒粒度呈反比，微粉碎后所過的篩網(wǎng)目數(shù)越大，黑木耳黑色素提取液吸光度值越大。

圖2 干粉微粉碎粒度對黑色素吸光度的影響Fig.2 Effect of dry powder particle size on melanin absorbance

當(dāng)顆粒粒度超過120 目（120 μm），隨著微粉碎顆粒粒度的減小，黑木耳黑色素提取液的吸光度值有所下降，該結(jié)果表明當(dāng)微粉碎粒度小于120 μm后，黑木耳黑色素提取液吸光度值會隨著微粉碎顆粒粒度的降低而降低。得到該結(jié)果的原因可能是因?yàn)楹谀径鷺悠肺⒎鬯轭w粒小于120 μm時，所選用的提取劑為堿性溶液，這樣會導(dǎo)致一些堿溶性雜質(zhì)的溶出量隨之增加，這些雜質(zhì)成分與黑木耳黑色素競爭溶出，從而導(dǎo)致黑木耳黑色素溶解度降低，使得吸光度有所下降[17]；亦有可能是因?yàn)樵谖⒎鬯榈倪^程中，為得到顆粒粒徑較小的黑木耳干粉原料需要更長的微粉碎時間，微粉碎時間的增長使得熱效應(yīng)增大，黑木耳干粉原料中黑色素的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其吸光度值降低。故選用微粉碎粒度120 μm的黑木耳干粉原料作為黑木耳黑色素超聲-微波聯(lián)用輔助提取法工藝中微粉碎顆粒粒度最佳參數(shù)條件。

2.2.2 超聲-微波聯(lián)用輔助提取最佳超聲功率的確定由圖3可知，當(dāng)超聲功率由300 W增大至400 W的過程中，黑木耳黑色素提取液的吸光度值持續(xù)增大，與超聲功率呈正比，當(dāng)超聲功率至400 W時，黑木耳黑色素提取液吸光度值達(dá)到最大；當(dāng)超聲功率由400 W持續(xù)增大時，可發(fā)現(xiàn)，黑木耳黑色素提取液的吸光度值有所下降，此范圍內(nèi)，超聲功率與黑木耳黑色素吸光度值呈反比。

該結(jié)果發(fā)生的原因可能因?yàn)槌暪β蔬^大所引起的機(jī)械剪切作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致提取液中黑木耳黑色素結(jié)構(gòu)因降解而發(fā)生變化，從導(dǎo)致?lián)p失[18]。由此可知，超聲功率400 W可作為超聲-微波聯(lián)用輔助提取黑木耳黑色素工藝中超聲功率最佳單因素條件。

2.2.3 超聲-微波聯(lián)用輔助提取最佳微波功率的確定由圖4可知，當(dāng)微波功率由100 W提升至400 W過程中，隨著微波功率的增大，黑木耳黑色素提取液的吸光度持續(xù)增大，當(dāng)微波功率達(dá)到400 W時，黑木耳黑色素提取液的吸光度值達(dá)到最大。隨著微波功率的持續(xù)增大，對于黑木耳黑色素提取液吸光度值的提升較小，與400 W微波功率參數(shù)條件基本一致。得到該結(jié)果的原因可能是由于提取包括擴(kuò)散、滲透、溶解等過程，隨著微波功率的增大，黑木耳微粉中黑色素釋放量增大，提取量亦增大。故提取所使用的微波功率越大，提取越完全；當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時，增大微波功率，提取率不再增大。從節(jié)省能源消耗方面考慮，將微波功率400 W設(shè)定為超聲-微波聯(lián)用輔助提取黑木耳黑色素工藝中微波功率最佳參數(shù)條件。

圖3 超聲功率對黑色素吸光度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on melanin absorbance

圖4 微波功率對黑色素吸光度的影響Fig.4 Effect of microwave power on the absorbance of melanin

2.2.4 超聲-微波聯(lián)用輔助提取最佳聯(lián)合時間的確定由圖5可知，不同的超聲-微波聯(lián)合作用時間參數(shù)對于黑木耳黑色素提取液吸光度值的影響不一，當(dāng)超聲-微波聯(lián)用時間參數(shù)設(shè)定為30 min時，黑木耳黑色素提取液吸光度值達(dá)到最大。但隨著所設(shè)定的聯(lián)合作用時間的持續(xù)增大，提取液吸光度值下降程度較為明顯。發(fā)生該種情況的原因可能是由于超聲-微波聯(lián)合用時間的過長，會使得黑木耳黑色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[19]，從而有所損失，導(dǎo)致黑木耳黑色素提取液的吸光度值降低。

相較于傳統(tǒng)溶劑提取法（90 min）及超聲波輔助提取法（80 min）的耗時較長，超聲-微波聯(lián)用輔助提取法可在短時間內(nèi)對黑木耳干粉原料中的黑色素進(jìn)行較為充分地提取，以此體現(xiàn)了超聲-微波聯(lián)用輔助提取法可縮短提取時間的優(yōu)點(diǎn)。由該結(jié)果可明確，單因素實(shí)驗(yàn)中最佳超聲-微波聯(lián)合作用時間參數(shù)為30 min。

圖5 超聲-微波聯(lián)用時間對黑色素吸光度的影響Fig.5 Effect of ultrasound-microwave combined action time on the absorbance of melanin

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。Box-Behnken 的3因素3水平試驗(yàn)共17個試驗(yàn)點(diǎn)，前12個是析因點(diǎn)，自變量取值在X1，X2，X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；后5個為零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，用來評估試驗(yàn)誤差。黑木耳黑色素提取Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黑木耳黑色素吸光度對超聲功率、微波功率、作用時間的二次多項(xiàng)回歸模型為。其中整體模型極為極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明方程和試驗(yàn)擬合較好，可以對超聲-微波聯(lián)用輔助提取法不同參數(shù)下黑木耳黑色素提取液的吸光度進(jìn)行預(yù)測。

對回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)見表3，可知各因素對黑木耳黑色素提取液吸光度影響的排序?yàn)椋郝?lián)合作用時間（X3）＞超聲功率（X1）＞微波功率（X2）。其中作用極顯著（P＜0.01），作用顯著（P＜0.05）。

2.3.2 分析響應(yīng)面和二維等高線圖 圖6、圖7、圖8是根據(jù)回歸方程所做出的響應(yīng)曲面和等高線圖，各圖形能夠直觀地反映出各因素之間的交互作用以及各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[20]。

由圖6可知，當(dāng)超聲功率一定時，黑木耳黑色素提取液的吸光值受微波功率的影響較小，隨著微波功率的增大，黑木耳黑色素提取液的吸光值先增大而后有所下降；而當(dāng)微波功率一定時，超聲功率對黑木耳黑色素提取液吸光值的影響較大，吸光度隨著超聲功率的增大而增大，但是當(dāng)超聲功率增大到一定的程度，隨著超聲功率的增大，黑木耳黑色素提取液的吸光值反而逐漸降低。超聲功率與微波功率的等高線排列疏松且橢圓曲率小，近似圓形。說明微波功率與超聲功率之間的交互作用不明顯。

表2 黑木耳黑色素提取 Box-Behnken 試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Scheme and results of Box-Behnken experiment for extraction of A. auricula-judae melanin

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖6 超聲功率和微波功率對黑色素吸光度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and microwave power on the absorbance of melanin

由圖7可以看出，黑木耳黑色素提取液的吸光值隨著提取時間的變化，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；超聲功率對于提取液的吸光值影響情況同樣一致，在超聲-微波聯(lián)合作用時間為30 min，超聲功率為400 W時，黑木耳黑色素提取液的吸光值達(dá)到最大。超聲功率與超聲-微波聯(lián)合作用時間的坡度陡峭，等高線較為密集，橢圓曲率較大。說明超聲功率與超聲-微波聯(lián)合作用時間之間交互作用有一定相關(guān)性，但經(jīng)過方差分析并不顯著。而且超聲-微波聯(lián)合作用時間的等高線相較超聲功率密集，說明超聲-微波聯(lián)合作用時間的影響大于超聲功率。

由圖8可以看出，在微波功率400 W，聯(lián)合作用時間為30 min時，黑木耳黑色素提取液的吸光值達(dá)到最大。微波功率變化曲面相較聯(lián)合作用時間變化曲面平緩，說明微波功率對黑木耳黑色素提取液吸光值的影響較聯(lián)合作用時間對黑木耳黑色素提取液吸光值的影響小，與方差分析的結(jié)果一致。從等高線圖可以看出，聯(lián)合作用時間軸向的等高線密集，說明聯(lián)合作用時間對黑木耳黑色素吸光值影響較大，而微波功率軸向的等高線相對稀疏，說明微波功率對黑木耳黑色素提取液吸光值影響較小[21]。

圖7 超聲功率和聯(lián)合作用時間對黑色素吸光度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and combined action time on the absorbance of melanin

圖8 微波功率和聯(lián)合作用時間對黑色素吸光度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour diagram of the effect of microwave power and combined action time on the absorbance of melanin

2.3.3 反應(yīng)條件優(yōu)化及模型驗(yàn)證 經(jīng)由Design-Expert 8.0.6.1軟件分析該模型下，黑木耳黑色素超聲-微波聯(lián)用輔助提取法最佳提取工藝條件為：超聲功率398.04 W、微波功率392.36 W、聯(lián)合作用時間30.79 min。此時，黑木耳黑色素提取液理論吸光度為0.993±0.003。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面可靠性，采用最佳提取工藝條件做黑木耳黑色素超聲-微波輔助提取驗(yàn)證試驗(yàn)。同時考慮到實(shí)際操作的可行性和局限性，將工藝參數(shù)修正為超聲功率398 W、微波功率392 W、聯(lián)合作用時間31 min。在修正條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測得黑木耳黑色素提取液的平均吸光度為0.984，與理論值0.993基本吻合。

將超聲-微波聯(lián)用輔助提取法最佳優(yōu)化工藝條件下所得到的上清液用3 mol/L鹽酸，沸水浴沉淀10 h，經(jīng)4000 r/min離心15 min后，取沉淀冷凍干燥后，測得粗黑色素得率（9.10%±0.45%），相較于傳統(tǒng)溶劑提取法粗黑色素得率（7.20%±0.25%）、超聲波輔助提取法粗黑色素得率（5.20%±0.35%），使用超聲-微波聯(lián)用輔助提取法，對于黑木耳粗黑色素的提取得率有較高的提升。表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黑色素提取條件準(zhǔn)確可靠，具有一定應(yīng)用價值。

2.4 不同提取方法處理黑木耳干粉形態(tài)分析

SEM觀察黑木耳組織經(jīng)過不同提取方法處理后的微觀結(jié)構(gòu)，如圖9A、B、C、D所示。

提取效率與植物組織細(xì)胞壁的物理變化存在一定關(guān)系[22]。不同提取方法處理對于黑木耳組織結(jié)構(gòu)的物理變化有著顯著影響。黑木耳組織樣品經(jīng)過粉碎處理后（圖9 A），其組織結(jié)構(gòu)幾乎完好無損，排列較為緊密，表明粉碎處理對于黑木耳組織的破壞程度較小。經(jīng)過與粉碎處理的黑木耳組織樣品相比，使用傳統(tǒng)溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超聲-微波聯(lián)用輔助提取法處理后（圖9 B、C、D）的黑木耳樣品組織結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，其組織結(jié)構(gòu)破壞程度由大到小排序依次為：超聲-微波聯(lián)用輔助提取法＞傳統(tǒng)溶劑提取法處理＞超聲波輔助提取法。

其中，與傳統(tǒng)溶劑提取法以及超聲波輔助提取法相比，經(jīng)超聲-微波聯(lián)用輔助提取法處理后的黑木耳組織樣品破損程度較為嚴(yán)重，組織形態(tài)完全改變，組織結(jié)構(gòu)排列松散；相較于傳統(tǒng)溶劑法，超聲波輔助提取法的超聲波會產(chǎn)生空化效應(yīng)，導(dǎo)致黑木耳組織樣品產(chǎn)生空洞，使其組織狀態(tài)發(fā)生改變；相較于粉碎處理，傳統(tǒng)溶劑提取法處理后的黑木耳組織樣品由于酸水解導(dǎo)致細(xì)胞壁中果膠的溶出，使得組織結(jié)構(gòu)聯(lián)結(jié)更加緊密，破化程度較小。

圖9 不同處理方法的黑木耳組織樣品掃描電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.9 Scanning electron microscope images of samples with different treatment methods

3 討論

與傳統(tǒng)溶劑提取法以及超聲波輔助提取法相比，經(jīng)超聲-微波聯(lián)用輔助提取法處理后的黑木耳組織樣品，破損程度較為嚴(yán)重，組織形態(tài)完全改變，組織結(jié)構(gòu)排列松散。這可能是由于超聲-微波聯(lián)用輔助提取法是一種結(jié)合超聲波和微波方法的新工藝技術(shù)。其中，微波可以較為快速地加熱整個樣品，誘導(dǎo)已溶解的分子發(fā)生遷移。同時，超聲波可增強(qiáng)傳質(zhì)，提高目標(biāo)產(chǎn)品的提取量[23]。其中，造成黑木耳組織結(jié)構(gòu)的破壞的原因，歸因于超聲引起的強(qiáng)烈震動，以及微波處理可以對黑木耳組織樣品進(jìn)行加熱和膨脹，從而引起沖擊和空化效應(yīng)[24]。

由不同黑木耳黑色素提取方法工藝所耗費(fèi)的時間來看，傳統(tǒng)溶劑提取法需耗費(fèi)90 min，超聲輔助提取法時長80 min，而使用超生-微波聯(lián)用輔助提取法對于黑木耳黑色素進(jìn)行提取，只需30 min即可，這是由于超聲系統(tǒng)可在瞬時產(chǎn)生大量的能量，從而使得黑色素從黑木耳組織內(nèi)部快速溶解至溶劑中，相對于滲透過程，耗時更短。同時，超聲系統(tǒng)可在瞬時產(chǎn)生大量的能量，從而使得黑色素從黑木耳組織內(nèi)部快速溶解至溶劑中，相對于滲透過程，耗時更短。另一方面，微波能量可有效地被提取溶劑吸收，并同時對樣品進(jìn)行有效加熱[25]。因此，提取溶劑可滲透進(jìn)入到組織內(nèi)部并劇烈膨脹，隨后導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破裂，使得黑木耳黑色素在超聲-微波聯(lián)合輔助提取期間大量釋放到提取溶劑中，從而提升黑木耳黑色素的提取量。SEM所提供的不同提取方法處理后的黑木耳組織結(jié)構(gòu)圖也印證了超聲-微波聯(lián)合輔助提取的優(yōu)勢所在，為超聲-微波聯(lián)用輔助提取法可提高黑木耳黑色素提取效率，提供了具有一定說服力的依據(jù)。

使用該方法對于黑木耳黑色素進(jìn)行提取，提取得率明顯高于傳統(tǒng)溶劑提取法及超聲波輔助提取法，可作為黑木耳黑色素的高效提取工藝方法。

4 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳超聲-微波聯(lián)用輔助提取黑木耳黑色素工藝條件為：超聲功率398 W、微波功率392 W、聯(lián)合作用時間31 min。此工藝條件下，黑木耳黑色素提取液吸光度值可達(dá)0.984±0.003，黑木耳黑色素粗提物得率為9.10%±0.45%；相較于傳統(tǒng)溶劑提取法得率7.20%±0.25%、超聲輔助提取法得率5.20%±0.35%，超聲-微波聯(lián)用輔助提取法分別提升了26.38%、75.00%，明顯高于該兩種方法。

同時，經(jīng)過不同提取方法處理后的黑木耳干粉樣品組織SEM圖像的比較，表明超聲-微波聯(lián)用輔助提取法相較于其他提取方法，對黑木耳干粉組織結(jié)構(gòu)的破壞程度較大。這些結(jié)果表明超聲-微波聯(lián)用輔助法提取黑木耳黑色素方法有一定優(yōu)勢所在，可節(jié)約資源，降低提取時間，并且提升提取得率。