紅毛藻多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

李 月，紀(jì)乃茹，李 健，王 力

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門(mén) 361021）

紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）又名紅毛菜，是一類(lèi)原始紅藻，屬紅藻門(mén)，紅毛菜目，紅毛藻屬。紅毛藻是泛暖溫帶海藻，主要生長(zhǎng)在北大西洋亞熱帶海區(qū)和溫帶海區(qū)以及北太平洋的西部，我國(guó)東海和南海沿岸地區(qū)是紅毛藻的主產(chǎn)地[1]。紅毛藻味道鮮美，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如各種氨基酸、糖質(zhì)、脂肪酸以及Ca、Mg和K等人體必需元素，其中總氨基酸為38.62%、總糖為27%、總脂肪酸為3.77%、鉀為3%[1-3]。有相關(guān)文獻(xiàn)記載，紅毛藻有抗氧化[4]、降血壓、滋陰?kù)罨鸷头乐渭膊〉茸饔肹5]，深受我國(guó)南部沿海地區(qū)以及東南亞地區(qū)消費(fèi)者的喜愛(ài)。福建省莆田市是我國(guó)紅毛藻的主要產(chǎn)地之一，每年約有100 t（干重）的產(chǎn)量，每噸紅毛藻價(jià)格約10～30萬(wàn)元，通常被作為食品原料銷(xiāo)售。目前，紅毛藻加工行業(yè)存在產(chǎn)品種類(lèi)單一、附加值低和競(jìng)爭(zhēng)力弱的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)利用程度較低[6]。

海藻多酚是海藻植物中多酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，大多以間苯三酚的衍生物和聚合物的形式存在，是具有拒食功能海藻的次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]。因其具有抑菌[8-9]、抗氧化[10]、抗癌[11]、降血糖[12-13]及治療肥胖[14-15]等生理活性和藥用功能，常被用于食品、化妝品、藥品及保健品等領(lǐng)域中。抗氧化是海藻多酚的重要生物活性，海藻多酚分子中的酚性羥基能夠切斷氧化過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物自由基、羥基自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而達(dá)到抑制和減緩氧化的效果[16]，在食品、化妝品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅毛藻的研究多集中在紅毛藻多糖、藻紅蛋白及其生理學(xué)特性，而對(duì)關(guān)于紅毛藻多酚的相關(guān)研究較少，現(xiàn)對(duì)紅毛藻中酚類(lèi)物質(zhì)的研究?jī)H僅是檢測(cè)出紅毛藻多酚含量[17]，而關(guān)于紅毛藻中多酚的提取方法和抗氧化能力研究未有相關(guān)報(bào)道。為充分利用我國(guó)豐富的紅毛藻資源，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，從而提高紅毛藻資源的利用率。

因此，本論文以干紅毛藻為原料，從其富含的酚類(lèi)成分的提取工藝優(yōu)化和抗氧化活性分析入手，采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化多酚的提取工藝，并以多酚對(duì)1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）及2,2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）的清除率考察紅毛藻多酚的抗氧化活性，旨在獲得紅毛藻多酚的最優(yōu)化提取工藝，研究紅毛藻的抗氧化活性，為紅毛藻的綜合加工利用奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅毛藻 福建莆田南日鎮(zhèn)人工養(yǎng)殖產(chǎn)品，購(gòu)于2019年1月；ABTS、DPPH、福林酚、沒(méi)食子酸 標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、過(guò)硫酸鉀、維生素 C（Vitamin C, VC） 分析純，西隴化工股份有限公司。

SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；RE-AA真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo公司；SPH-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；En Spire2300型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；H2050R離心機(jī) 廈門(mén)億辰科技有限公司；DHG-101B型烘箱 佰輝儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅毛藻多酚的提取 將50 ℃恒溫干燥后的紅毛藻粉碎過(guò)60目篩，得到紅毛藻藻粉。取1.0 g的藻粉加入一定量的乙醇溶劑，在設(shè)定好的溫度下浸提一定時(shí)間，再經(jīng)8000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定多酚的提取量。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 以參考文獻(xiàn)方法[18]，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，采用福林酚法，測(cè)定樣品溶液在762 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度X（mg/mL）作為橫坐標(biāo)、762 nm處測(cè)得的吸光值Y為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到的回歸方程為

Y=125.79X+0.0564，R2=0.9991。

1.2.3 紅毛藻多酚含量計(jì)算 吸取1 mL多酚提取液于具塞試管中，加入1.5 mL福林酚試劑，混勻靜置3 min，隨后加入3 mL 12%的Na2CO3溶液, 定容至10 mL，混勻避光反應(yīng)2 h，于762 nm測(cè)定吸光值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算紅毛藻多酚濃度，按下式計(jì)算紅毛藻多酚提取量：

式中：C為紅毛藻多酚的濃度，mg/mL；V為多酚提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為紅毛藻粉質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 提取時(shí)間對(duì)多酚提取效果的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定浸提溫度70 ℃，料液比1:20 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，設(shè)定浸提時(shí)間40、50、60、70、80 min，研究多酚提取量的變化趨勢(shì)。

1.2.4.2 提取溫度對(duì)多酚提取效果的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間1 h，設(shè)定提取溫度60、65、70、75、80 ℃，研究多酚提取量的變化趨勢(shì)。

1.2.4.3 料液比對(duì)多酚提取效果的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間1 h，設(shè)定料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL），研究多酚提取量的變化趨勢(shì)。

1.2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取效果的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定提取溫度70 ℃，料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間1 h，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、55%、60%、65%、70%，研究多酚提取量的變化趨勢(shì)。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用L9（34）正交試驗(yàn)（表1），研究提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅毛藻多酚提取的影響，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 抗氧化試驗(yàn)

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 按參考文獻(xiàn)方法[19]適當(dāng)修改，現(xiàn)配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，及不同濃度的多酚樣品溶液，在試管中先加入2 mL DPPH乙醇溶液再加入1.5 mL的多酚樣品溶液，混勻后置于37 ℃，暗條件下反應(yīng)30 min，結(jié)束后測(cè)定517 nm 處吸收值，以VC作對(duì)照，計(jì)算DPPH自由基的清除率。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

式中: A0：1.5 mL蒸餾水+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；A1：1.5 mL樣品溶液或VC+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；A2：1.5 mL樣品溶液或VC+2 mL無(wú)水乙醇的吸光值。

1.2.6.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[20]，將7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀等比例混合靜置過(guò)夜12 h，配得ABTS母液，無(wú)水乙醇將母液稀釋至其在 734 nm處吸光度穩(wěn)定在0.70±0.02。取不同濃度的多酚樣品溶液0.1 mL加入ABTS稀釋液1 mL，混勻并于室溫反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處的吸光度，以VC為對(duì)照，計(jì)算ABTS自由基清除率。

其中，A0：0.1 mL 蒸餾水 + 1 mL ABTS溶液的吸光值；A1：0.1 mL樣品溶液或VC+ 1 mL ABTS溶液的吸光值；A2：0.1 mL樣品溶液或VC+ 1 mL無(wú)水乙醇吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 提取時(shí)間對(duì)紅毛藻多酚提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time fraction on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)紅毛藻多酚提取量的影響 由圖1可知，提取初始時(shí)，增加提取時(shí)間使得紅毛藻多酚提取量不斷增加，在60 min時(shí)達(dá)到最高，但繼續(xù)增加提取時(shí)間，多酚的提取率反而降低。這可能是由于浸提60 min時(shí)，多酚溶出已達(dá)到平衡，隨提取時(shí)間增加，溶液中溶出的紅毛藻多酚逐漸被氧化損耗，使多酚物質(zhì)被分解致使變性，結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致紅毛藻多酚的提取量下降[21]，此外長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)造成資源浪費(fèi)。因此，選擇60 min作為紅毛藻多酚的最佳提取時(shí)間。

2.1.2 提取溫度對(duì)紅毛藻多酚提取量的影響 由圖2可知，紅毛藻多酚提取量隨著提取溫度的升高呈直線(xiàn)升高而后下降，當(dāng)提取溫度70 ℃時(shí)，多酚提取量達(dá)到最高，為8.60 mg/g。當(dāng)溫度增加至80 ℃時(shí)，多酚提取量降低。這可能是由于溫度的升高加快了分子運(yùn)動(dòng)，增加酚類(lèi)物質(zhì)溶出，從而提高了紅毛藻多酚的提取量。但溫度過(guò)高可能使得多酚的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，另外高溫加速了紅毛藻多酚的氧化及降解，導(dǎo)致紅毛藻多酚提取量降低[22]。因此，選擇溫度70 ℃作為紅毛藻多酚的最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)紅毛藻多酚提取的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.1.3 料液比對(duì)紅毛藻多酚提取量的影響 由圖3可知，在料液比 1:10 g/mL溶液過(guò)于黏稠，提取不充分，隨著料液比的增加，溶液黏度下降，使細(xì)胞內(nèi)外多酚有較高的濃度差，促進(jìn)使紅毛藻中酚類(lèi)物質(zhì)向提取液中擴(kuò)散[23]，在料液比增大到1:20 g/mL時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，為8.35 mg/g。但當(dāng)繼續(xù)提高溶劑的體積，多酚的提取量隨之下降，是因?yàn)楫?dāng)提取劑達(dá)到一定量時(shí)，多酚已基本浸出，而此時(shí)有多糖、色素等其他物質(zhì)溶出，出現(xiàn)反滲透現(xiàn)象，導(dǎo)致多酚提取量下降。因此，選擇1:20 g/mL作為紅毛藻多酚提取的最佳料液比。

圖3 料液比對(duì)紅毛藻多酚提取的影響Fig.3 Effect of material to liquid ratio on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅毛藻多酚提取量的影響 由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度在50%～60%時(shí)，紅毛藻多酚提取量隨著體積分?jǐn)?shù)增加而增長(zhǎng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，多酚的提取量達(dá)到最大。而后，隨乙醇濃度的提高，多酚提取量呈下降趨勢(shì)。這情況可能是由于乙醇濃度過(guò)高，多酚與溶劑極性相差較大，蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致多酚溶解度降低，同時(shí)醇溶性雜質(zhì)、色素成分的溶出也會(huì)影響提取效果[24-25]。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇作為最佳提取溶劑。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅毛藻多酚提取的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化溶劑浸提法提取紅毛藻中總多酚，平行測(cè)定三次，得出工藝優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。優(yōu)化得到紅毛藻多酚的最佳提取工藝：A3B2C1D2，即提取時(shí)間70 min、提取溫度70 ℃、料液比1:10 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。由極差結(jié)果可知，影響提取效果的主次順序?yàn)椋篊（料液比）＞A（提取時(shí)間）＞B（提取溫度）＞D（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。采用SPSS進(jìn)行方差分析，進(jìn)一步研究各因素對(duì)紅毛藻總酚提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)表3。由此得知，料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)均極顯著影響紅毛藻多酚提取效果（P＜0.01）。在最佳條件下提取紅毛藻多酚對(duì)其進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多酚提取量為（9.67±0.14）mg/g。此方法提取的紅毛藻多酚提取量高于昆布（1.79 mg/g）[26]和龍須菜（1.62 mg GAE/g）[27]，說(shuō)明此方法提取紅毛藻多酚是可行的。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results

2.3 抗氧化結(jié)果

2.3.1 紅毛藻多酚對(duì)DPPH自由基清除能力 DPPH醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收，海藻多酚可捕捉DPPH自由基的單電子，使其顏色變淺，從而降低吸收值，因而根據(jù)吸收值的變化，判斷多酚抗氧化效果[28]。由圖5可知，紅毛藻多酚自由基清除率隨質(zhì)量濃度增加而增大，其濃度從0.2 mg/mL增加至1.6 mg/mL時(shí)，多酚對(duì)DPPH自由基的清除率從36.7%上升至93.1%。VC的清除率在高濃度時(shí)一直保持在96.9%。由試驗(yàn)結(jié)果得到紅毛藻多酚IC50為0.313 mg/mL，多酚在較低濃度時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除能力低于VC，但增加多酚濃度其抑制效果逐漸接近VC，增幅較為明顯。紅毛藻多酚的抗氧化結(jié)果可能與紅毛藻原料的處理方式有關(guān)，日曬、烘干使得多酚由于高溫或空氣氧化原因被降解，抗氧化活性降低[29]。研究認(rèn)為某種物質(zhì)清除自由基的IC50小于10 mg/mL，表明其具有一定的抗氧化作用[30]，由此可見(jiàn)紅毛藻多酚仍表現(xiàn)出較好的清除DPPH自由基效果。

圖5 紅毛藻多酚對(duì)DPPH·的清除效果Fig.5 DPPH·radical-scavenging activities of polyphenols of Bangia fusco-purpurea

2.3.2 紅毛藻多酚對(duì)ABTS自由基清除能力 ABTS被氧化后得到穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS+·，當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化活性成分時(shí)，ABTS自由基與其反應(yīng)被清除，使得溶液顏色變淺，從而在734 nm處的吸光度降低。研究表明，吸光度越低，多酚的抗氧化能力越強(qiáng)，顏色越淺[31]。由圖6可知，低濃度時(shí)多酚的清除自由基能力始終低于VC，但隨著多酚濃度的增加，清除率不斷提高，并顯示濃度依賴(lài)性。紅毛藻多酚濃度在0.445 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到50%。而當(dāng)多酚濃度在1.4 mg/mL時(shí)，自由基清除率達(dá)到96.6%，與同濃度的VC清除效果相差較小，表明紅毛藻多酚具有較好的清除ABTS自由基的能力。

圖6 紅毛藻多酚對(duì)ABTS+·的清除效果Fig.6 ABTS+· radical-scavenging capacity of polyphenols of Bangia fusco-purpurea

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)紅毛藻多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取工藝組合為：提取時(shí)間70 min、提取溫度70 ℃、料液比1:10 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，得到多酚提取量為（9.67±0.14）mg/g。此乙醇溶液浸提紅毛藻多酚的提取方法具有低毒性和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，具有可行性。由抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，紅毛藻多酚具有良好的抗氧化能力，其清除DPPH自由基、ABTS自由基的IC50值分別為0.313、0.445 mg/mL。紅毛藻多酚清除自由基能力與多酚濃度呈正相關(guān)，且其抗氧化效果均高于銅藻、泡葉藻、樹(shù)皮藻[32]，呈現(xiàn)較突出的抗氧化作用。紅毛藻中含有較為豐富的多酚，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可發(fā)展成為天然抗氧化劑或食品添加劑，從而提高紅毛藻多酚的綜合利用價(jià)值。本研究為進(jìn)一步深入開(kāi)展對(duì)紅毛藻多酚提取、活性的研究提供基礎(chǔ)參考，為拓展紅毛藻深加工產(chǎn)品領(lǐng)域提供思路。