一株豬A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬細(xì)菌，可感染豬、牛、羊、兔、雞等多種動(dòng)物和人，是一種重要的人獸共患病原菌[1]。Pm可在健康動(dòng)物上呼吸道定植，是一種條件性致病菌，分為A、B、D、E和F等5個(gè)血清型[2]。目前報(bào)道除E型外，其余血清型均可感染豬后引起豬巴氏桿菌?。簇i肺疫）[3]。豬巴氏桿菌病臨床表現(xiàn)主要為敗血癥、肺炎、萎縮性鼻炎等，該病廣泛存在于世界各地，隨著我國(guó)禁抗時(shí)代的來(lái)臨，該病呈高發(fā)態(tài)勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

2020年11月東營(yíng)某豬場(chǎng)豬精神沉郁，采食量減少，體溫升高，口鼻有白色泡沫流出，個(gè)別豬只呈犬坐姿勢(shì)，呼吸極度困難，嚴(yán)重者死亡，剖檢可見(jiàn)死豬氣管內(nèi)充滿泡沫，肺出血、間質(zhì)增寬、水腫。本試驗(yàn)無(wú)菌采集病死豬肝臟、肺臟等樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)及PCR鑒定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料

對(duì)東營(yíng)某豬場(chǎng)疑似巴氏桿菌病死豬剖檢，無(wú)菌采取肝臟、肺臟等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

10只16～20 g昆明小白鼠購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試劑

普通瓊脂平板、含5%血清的TSA瓊脂平板、TSB液體培養(yǎng)基、革蘭氏染色液如草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復(fù)紅染液等均由山東綠都生物科技有限公司質(zhì)量監(jiān)察部提供；糖發(fā)酵管及生化反應(yīng)試劑和藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR反應(yīng)試劑Taq酶、10×PCR Buffer、DL 2 000 DNA Marker、瓊脂糖DNA凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購(gòu)自百泰克生物科技有限公司；pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物公司。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)巴氏桿菌PCR鑒定和分型引物，鑒定引物為巴氏桿菌通用引物，擴(kuò)增基因片段大小為457 bp，分型引物用于擴(kuò)增A、B、D、E、F等不同巴氏桿菌血清型，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度分別為1 048 bp、758 bp、647 bp、512 bp和852 bp。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

2 方法

2.1 直接涂片鏡檢

無(wú)菌采取病死豬肝臟、肺臟，玻片直接觸片，干燥，固定后，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢觀察。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的豬心血、肝臟、脾臟無(wú)菌劃線接種于血液瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況，對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢[5]。挑取單個(gè)可疑菌落接種于麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2.3 生化鑒定

分離菌經(jīng)含5%血清的TSA瓊脂平板純培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)及其他生化試驗(yàn)。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，將分離菌純化后，接種TSB液體培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，無(wú)菌棉簽均勻涂布在TSA培養(yǎng)基上，用鑷子夾取藥敏紙片放置在平板上，保持紙片間適度距離，每個(gè)平板上最好不超過(guò)6張藥敏紙片。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

2.5 致病性試驗(yàn)

10只昆明小鼠，隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。吸取細(xì)菌純培養(yǎng)液，腹腔注射試驗(yàn)組小鼠0.2 mL/只 （菌體含量6×109CFU/mL），5只對(duì)照組小鼠分別腹腔注射0.2 mL TSB液體培養(yǎng)基作對(duì)照。注射后隔離飼養(yǎng)，定期觀察小鼠狀態(tài)，并記錄觀察結(jié)果。

2.6 PCR鑒定及分型

挑取TSA瓊脂平板上分離菌單菌落，接種于含5%血清的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱，200 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h，提取細(xì)菌基因組DNA作模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定及分型檢測(cè)。反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer（含MgCl2）2μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/L）。dNTP 2 μL，Tag DNA聚合酶0.2 μL，模板1 μL，加水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)：72 ℃ 10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物純化回收后，連到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑單菌落，搖床培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，并初步鑒定正確后，送生工生物工程（青島）股份有限公司測(cè)序。

3 結(jié)果與分析

3.1 直接涂片鏡檢

肝臟、脾臟觸片后革蘭氏染色后鏡檢，可見(jiàn)單個(gè)、散在的紅色短桿狀細(xì)菌，符合巴氏桿菌特性。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

普通瓊脂平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，在鮮血瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)灰白色、半透明、露珠樣、光滑圓潤(rùn)、邊緣整齊菌液。挑取單個(gè)菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓、中間微凸，單個(gè)存在、散在排列的短小桿菌。在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

3.3 生化試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1，所分離巴氏桿菌不能發(fā)酵水楊苷、肌醇、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，能發(fā)酵葡萄糖、纖維二塘、蔗糖、木糖、果糖、半乳糖、海藻糖、山梨醇， V-P試驗(yàn)陰性，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，與巴氏桿菌的生化特征一致。

表1 分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果

3.4 藥物敏感性試驗(yàn)

由表2可知，分離菌對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、阿米卡星、磷霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感，對(duì)阿奇霉素、大觀霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、卡那霉素、林可霉素耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 mm

3.5 致病性試驗(yàn)

小鼠注射分離菌液4 h后，采食減少，不愛(ài)運(yùn)動(dòng)，呼吸急促，16 h后被毛粗亂，眼瞼水腫、四肢發(fā)紺、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，24 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，72 h內(nèi)試驗(yàn)組小鼠全部死亡。剖檢可見(jiàn)小鼠肝臟有白色壞死點(diǎn)、肺臟出血、脾臟腫大、出血，腸道出血。取肝臟組織觸片，革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)呈革蘭氏染色陰性的紅色短小桿菌。對(duì)照組小白鼠全部健活。

3.6 PCR鑒定及分型

采用巴氏桿菌通用引物對(duì)分離菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，在457 bp位置有特異性目的條帶，說(shuō)明分離菌為巴氏桿菌。隨后采用5對(duì)分型引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示A型引物產(chǎn)物在1 048 bp出現(xiàn)特異性條帶，其余均無(wú)目的條帶，初步說(shuō)明分離菌為A型巴氏桿菌。

3.7 基因克隆的測(cè)序分析

為進(jìn)一步確認(rèn)，將擴(kuò)增的1 048 bp基因條帶切膠回收，純化后，連pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，采用PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，將含有插入片段的陽(yáng)性質(zhì)粒送去測(cè)序。將測(cè)得序列與GenBank中收錄的巴氏桿菌的進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，分離菌與巴氏桿菌A型序列同源性為100%。

4 討論

豬巴氏桿菌病是豬的一種重要的細(xì)菌性傳染病，呈散發(fā)和地方流行性，無(wú)明顯季節(jié)性，當(dāng)天氣劇變、飼養(yǎng)條件改變、長(zhǎng)途運(yùn)輸或豬群遭受其他應(yīng)激因素影響時(shí)，或豬群抵抗力降低時(shí)容易誘發(fā)。豬巴氏桿菌病主要應(yīng)以預(yù)防為主，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，飼喂優(yōu)質(zhì)全價(jià)配合飼料，飲用清潔水，提供適宜的溫度和濕度，做好通風(fēng)換氣，較少豬群應(yīng)激，做好其他常規(guī)疾病的免疫預(yù)防工作，也可以接種豬巴氏桿菌疫苗進(jìn)行預(yù)防。發(fā)病后可用抗生素治療，隨細(xì)菌耐藥性的增加，有時(shí)盲目用藥，往往治療效果不理想，需要借助實(shí)驗(yàn)室手段，提高豬群治療效果。

本試驗(yàn)對(duì)東營(yíng)某豬場(chǎng)死亡豬只送檢病料進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定，血清型鑒別，藥敏試驗(yàn)和小鼠致病性試驗(yàn)。結(jié)果表明，所分離的A型巴氏桿菌，PCR血清分型方法的應(yīng)用大幅縮短了巴氏桿菌血清分型鑒定時(shí)間，為進(jìn)一步驗(yàn)證，測(cè)定相關(guān)基因序列，并比對(duì)分析，符合率為100%，為今后豬巴氏桿菌快速分型鑒定提供了可靠依據(jù)。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌生化特征與巴氏桿菌一致，不能發(fā)酵水楊苷、肌醇、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，能發(fā)酵葡萄糖、纖維二塘、蔗糖、木糖、果糖、半乳糖、海藻糖、山梨醇，V-P試驗(yàn)陰性，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離株對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對(duì)阿奇霉素、大觀霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、卡那霉素、林可霉素耐藥。建議豬場(chǎng)發(fā)生巴氏桿菌病后，分離病原菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選有效藥物，進(jìn)行聯(lián)合用藥，或輪換和穿插用藥，提高治療效果，防止盲目用藥及重復(fù)用藥耐藥性的產(chǎn)生，達(dá)到事半功倍的功效。致病性試驗(yàn)表明，分離菌可致小鼠發(fā)病，出現(xiàn)明顯癥狀，最終導(dǎo)致試驗(yàn)組小鼠全部死亡，該分離菌具有較強(qiáng)毒力，為豬場(chǎng)自家苗研制奠定了基礎(chǔ)。