湖南岳陽豬葡萄球菌分離鑒定及耐藥性分析

范方程，王 文，彭娜娜，寧慧敏，董 偉

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

仔豬滲出性皮炎又稱“豬油皮病”，該病是由豬葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）感染所引起，不同階段豬群對(duì)該病均易感，但多發(fā)于斷奶仔豬和哺乳仔豬。仔豬感染該病后臨床癥狀主要表現(xiàn)為消瘦、厭食、脫毛、皮膚表面紅斑和漿液滲出形成濕疹性皮炎和滲出性皮炎等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致發(fā)病豬脫水死亡[1]。仔豬滲出性皮炎的發(fā)生無明顯的地域性和季節(jié)性，但在夏季和秋季多發(fā)，存在高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。此外，豬葡萄球菌也可感染人，但相關(guān)案例較為少見[3]。

目前我國(guó)養(yǎng)豬模式正逐漸從散養(yǎng)化向規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖過渡，但大規(guī)模養(yǎng)殖容易導(dǎo)致疫病多發(fā)。豬葡萄球菌在豬場(chǎng)中十分常見，但該病感染導(dǎo)致的臨床癥狀（仔豬滲出性皮炎）容易與其它疾病混淆，如豬疥螨病[4]。因此對(duì)于豬病的診斷，我們需要在臨床診斷的基礎(chǔ)上借助實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行診斷與分析，以快速而準(zhǔn)確地對(duì)致病原進(jìn)行確診，為疾病的防治提供依據(jù)。2020年4月初，湖南岳陽某規(guī)?；i場(chǎng)部分仔豬發(fā)生滲出性皮炎，筆者通過臨床觀察結(jié)合實(shí)驗(yàn)室技術(shù)診斷結(jié)果，最終確定該病由豬葡萄球菌感染引起，且進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該致病菌對(duì)部分抗生素具有耐藥性，其研究結(jié)果為該病的進(jìn)一步防控提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 湖南岳陽某規(guī)?；i場(chǎng)飼養(yǎng)繁殖母豬400余頭，2020年4月初該場(chǎng)產(chǎn)房部分欄舍仔豬出現(xiàn)滲出性皮炎，且有數(shù)十頭仔豬死亡。為探究發(fā)病原因，該場(chǎng)獸醫(yī)于4月中旬無菌采集病死豬心臟、肺臟和病變皮膚組織送至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院進(jìn)行病原診斷。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、2×Taq master mix、DL 5 000 DNA Marker等試劑均購(gòu)自于TakaRa公司；藥敏紙片購(gòu)自于杭州微生物試劑有限公司；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和果糖等購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原分離與革蘭氏染色鑒定 使用滅菌眼科剪和手術(shù)刀切取少量心臟、肺臟和皮膚病變組織混合后切碎，與適量滅菌生理鹽水混合，加入磁珠高速勻漿，離心后取上清液。在無菌操作臺(tái)用滅菌接種環(huán)蘸取少量上清液接種在普通瓊脂培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基表面是否有菌落形成。如果有，則用革蘭氏染色法對(duì)分離菌株進(jìn)行染色，隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定 將分離的菌株接種于普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)與純化，然后將單一菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等微量生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 分離菌株16S rRNA基因序列擴(kuò)增及測(cè)序 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]合成用于PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由北京擎科生物科技有限公司長(zhǎng)沙分公司合成。

將分離菌株接種在液體瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)增，然后取適量菌液用于DNA基因組提取，其具體步驟參考相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。以提取菌株基因組為模板，通過PCR法對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。其PCR體系（50.0 μL）包括2×PCR mix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板3 μL及雙蒸水20 μL，每次反應(yīng)均設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，其模板分別為已知葡萄球菌DNA和雙蒸水；擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，將PCR陽性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司長(zhǎng)沙分公司雙向測(cè)序。

1.2.4 分離株16S rRNA基因序列分析 將測(cè)序結(jié)果用DNA Star 5.0軟件進(jìn)行拼接，其后在NCBI上下載豬葡萄球菌及其它豬常見細(xì)菌性病原的16S rRNA基因序列。應(yīng)用DNA Star 5.0軟件分析本文獲得序列與參考菌株核苷酸序列同源性，同時(shí)采用MEGA 6.0軟件中的Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 將12只日齡、體重和性別一致的昆明小鼠分為2組，每組6只，對(duì)組Ⅰ小鼠腹腔注射分離菌原液0.2 mL/只，組Ⅱ腹腔注射等體積的生理鹽水。對(duì)各組小鼠攻毒后觀察其臨床癥狀及體重變化等，并記錄相應(yīng)的結(jié)果。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：將分離純化菌稀釋至1×108CFU/mL，取100 μL稀釋菌液均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基表面，待菌液稍干，取不同藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定不同藥敏紙片抑菌圈直徑，根據(jù)該產(chǎn)品相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定及生化試驗(yàn)結(jié)果

將病料組織勻漿后取上清液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌分離，在37 ℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出邊緣整齊的乳白色光滑菌落；進(jìn)一步革蘭氏染色結(jié)果如圖1所示：菌體呈藍(lán)紫色球狀，為革蘭氏陽性菌，部分菌體單個(gè)或成對(duì)存在，大多數(shù)菌體聚集在一起呈葡萄串狀；而生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等指標(biāo)為陽性，硫化氫、V-P試驗(yàn)等為陰性（表1）。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2 分離菌株16S rRNA基因序列擴(kuò)增結(jié)果及序列分析

以該菌株基因組為模板，用PCR法對(duì)其16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，該菌株16S rDNA基因PCR產(chǎn)物大小約1 500 bp，與預(yù)期片段大小基本一致，且陰性和陽性對(duì)照成立。

圖2 分離菌株16S rDNA擴(kuò)增PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

進(jìn)一步序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株16S rRNA基因序列與已知豬葡萄球菌分離株（登錄號(hào)：MW485735）同源性最高，為99.62%，但與其它細(xì)菌性病原對(duì)應(yīng)序列同源性相對(duì)較低。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果如圖3所示，本試驗(yàn)分離的菌株與已知豬源葡萄球菌（MW485735）同屬一個(gè)分支，由此推斷本文獲得的菌株為豬葡萄球菌。

圖3 分離株16S rRNA基因序列與相關(guān)致病菌遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

組Ⅰ小鼠接種豬葡萄球菌5～7 d后，精神萎靡、不愿活動(dòng)，肉眼可見接種部位皮膚處有被毛脫落和炎性物質(zhì)滲出，背部皮膚出現(xiàn)紅色皰疹，隨后有潰爛等，但無小鼠死亡現(xiàn)象。且與組Ⅱ小鼠相比，其體重和采食量均有所下降。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用KB擴(kuò)散法檢測(cè)該分離菌對(duì)不同抗生素的敏感性，結(jié)果如表2所示，分離菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢哌酮、阿莫西林、氟苯尼考、萬古霉素、多西環(huán)素、磺胺異噁唑敏感，對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星中敏，對(duì)林可霉素耐藥。

表2 分離菌株耐藥性分析結(jié)果

3 討論

豬葡萄球菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降時(shí)病原菌便可通過皮膚損傷處和皮膚黏膜感染宿主。豬是該病原的易感動(dòng)物，該病感染可引起豬關(guān)節(jié)炎、敗血癥及皮膚化膿。近年來，豬葡萄球菌病在我國(guó)各地豬場(chǎng)均有發(fā)生，這無疑嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)對(duì)養(yǎng)豬從業(yè)人員健康也造成威脅。

2020年4月初，湖南岳陽某規(guī)?；i場(chǎng)部分仔豬暴發(fā)疑似豬葡萄球菌感染導(dǎo)致的仔豬滲出性皮炎，通過細(xì)菌分離、革蘭氏染色及16S rRNA基因序列擴(kuò)增與分析發(fā)現(xiàn)該致病菌為豬葡萄球菌。為初步分析本試驗(yàn)分離株葡萄球菌的致病性，以昆明小鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行初步探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)較嚴(yán)重的臨床癥狀，如皮膚接種處有被毛脫落或潰瘍等，但未對(duì)小鼠致死，這在一定程度上說明該菌具有較低的致病性。

養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展在一定程度上得益于抗生素的使用，但這也導(dǎo)致豬場(chǎng)各種耐藥菌的產(chǎn)生。梁榮等[6]對(duì)廣東省豬源葡萄球菌耐藥性分析結(jié)果表明，1 485株豬源葡萄球菌對(duì)紅霉素、四環(huán)素、克林霉素、氟苯尼考等抗生素耐藥性嚴(yán)重，其耐藥率分別為91.0%、90.2%、84.6%和82.0%；岑靜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，湖南地區(qū)分離的豬葡萄球菌對(duì)青霉素、慶大霉素、林可霉素和氟苯尼考等具有耐藥性。但本試驗(yàn)分離的菌株對(duì)大部分被測(cè)抗生素十分敏感，如青霉素、氨芐西林和氟苯尼考等，僅對(duì)林可霉素耐藥。與該場(chǎng)負(fù)責(zé)人溝通得知該場(chǎng)平時(shí)較少使用抗生素，這可能是該場(chǎng)分離葡萄球菌對(duì)大部分常用抗生素敏感的主要原因。