全球首個(gè)單針圓支二聯(lián)苗（瑞圓舒）的創(chuàng)新工藝與攻毒試驗(yàn)

姚 晶，王科文

[碩騰（上海）企業(yè)管理有限公司，上海 長寧 200050]

一直以來，疫苗免疫的便捷性是養(yǎng)豬生產(chǎn)者的追求；尤其是在非洲豬瘟大背景下，更加催生了養(yǎng)豬生產(chǎn)者對便捷性的需求。因此，為了迎合養(yǎng)豬生產(chǎn)者的需求，行業(yè)內(nèi)出現(xiàn)了混合疫苗的各種亂象—多種疫苗混合免疫。筆者認(rèn)為在考慮滿足行業(yè)需求的同時(shí)，也要考慮是否給養(yǎng)豬生產(chǎn)者帶來了真正的益處。

養(yǎng)豬也是一門生意，最終養(yǎng)豬生產(chǎn)者是要賺取利潤的，如此才能立于行業(yè)不敗之地。不合理的混合免疫在當(dāng)前相對高豬價(jià)的行情下帶來的損失可能是可以承受的，但是這其實(shí)是在降低豬場生產(chǎn)者的利潤，降低其競爭力；接下來的半年、一年、兩年甚至五年，養(yǎng)豬場還能活多久？行業(yè)內(nèi)不乏有這樣的案例：豬場同樣利潤的情況下，你養(yǎng)的母豬數(shù)是別人的好幾倍。

我們不能只看到眼前的方便，還要注重其后期的效果，真正給養(yǎng)豬生產(chǎn)者帶來效益；或者說我們在保障效果的情況下來考慮其便捷性。碩騰即將在中國上市的豬圓環(huán)病毒（PCV）與豬肺炎支原體（MH）二聯(lián)苗—瑞圓舒—就是既有效果又便捷的單針疫苗。文章將從創(chuàng)新工藝和攻毒試驗(yàn)來介紹瑞圓舒的有效性。

1 瑞圓舒的創(chuàng)新工藝

研制圓支二聯(lián)苗的主要問題：豬血清中生長的豬肺炎支原體抗原和PCV抗原缺乏兼容性。豬血清含有多種針對各種抗原（包括PCV2）的特異性抗體。不幸的是，當(dāng)把PCV抗原做成聯(lián)苗時(shí)，豬肺炎支原體部分中的抗PCV抗體會(huì)結(jié)合PCV抗原。

為解決這個(gè)重大問題，針對瑞圓舒中豬肺炎支原體部分的生產(chǎn)，碩騰研究人員開發(fā)一種改進(jìn)的下游生產(chǎn)工藝。

在豬肺炎支原體細(xì)胞生長過程中，免疫原性成分被釋放到培養(yǎng)液中；這種無細(xì)胞的肺炎支原體培養(yǎng)上清液與沉淀的整個(gè)肺炎支原體細(xì)胞相比，同樣可以實(shí)現(xiàn)對豬肺炎支原體的免疫保護(hù)。瑞圓舒疫苗中的肺炎支原體抗原代表了一種無細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)品，這意味著只有可溶性豬肺炎支原體蛋白被用來誘導(dǎo)豬的免疫反應(yīng)，而不是整個(gè)滅活的支原體。這樣通過去除疫苗中不必要的成分使其安全性更高，且更有針對性地刺激免疫應(yīng)答。

簡單地去除肺炎支原體細(xì)胞并不能使豬肺炎支原體抗原與PCV2抗原兼容。因此，碩騰科學(xué)家引入了一種從含有豬肺炎支原體的培養(yǎng)液中除去抗PCV抗體的方法—“蛋白質(zhì)A”層析法。通過使用蛋白質(zhì)A去除肺炎支原體部分的PCV抗體（及其他無關(guān)的IgG抗體），聯(lián)苗中的PCV抗原仍然有效。事實(shí)上，研究評估了多種全細(xì)胞和無細(xì)胞培養(yǎng)液上清豬肺炎支原體抗原的組合，最后證實(shí)了無細(xì)胞、蛋白質(zhì)A處理的豬肺炎支原體抗原是非常高效的。

最后，同樣重要的是找到合適的佐劑來同時(shí)優(yōu)化疫苗中兩種抗原的效力。研究人員進(jìn)行了多次試驗(yàn)，比較了3種佐劑，以確定最安全、最有效的佐劑。在評估的佐劑中，選擇了MetaStim，其在聯(lián)苗中具有很好的有效性和安全性。幾十年來，MetaStim佐劑已成功地用于豬、牛和馬的疫苗中。該佐劑的優(yōu)勢包括針對滅活苗和活疫苗均能很好地刺激體液免疫和細(xì)胞免疫、不殺害活病毒活性、無礦物油、通針性好及無過敏反應(yīng)等。

2 瑞圓舒的攻毒試驗(yàn)

2.1 PCV2攻毒試驗(yàn)

免疫后3周攻毒試驗(yàn)：選取了48頭平均3周齡臨床健康的雜種斷奶仔豬，仔豬PCV2血清學(xué)陰性并且沒有病毒血癥；所有仔豬隨機(jī)（24頭/組）分為對照組（沒有PCV抗原，只有MH抗原）和瑞圓舒組（Fostera PCV MH）；接種疫苗3周后（試驗(yàn)第21天），豬只通過肌肉注射1 mL和鼻內(nèi)吸入2 mL共接種3 mL PCV2a（攻毒階段6～9周齡）。

每天觀察豬只的總體健康狀況及呼吸困難、嗜睡等臨床癥狀。每周收集血清樣品和攻毒階段的糞便拭子，并分析PCV2病毒血癥、糞便排毒和抗體水平。攻毒后3周對所有豬只進(jìn)行剖檢，并采集組織樣品來評估組織細(xì)胞浸潤情況、淋巴衰竭和免疫組化（IHC，檢查組織中的PCV）。

試驗(yàn)結(jié)果：瑞圓舒（Fostera PCV MH）組和對照組相比，疫苗接種減少了91.3%豬只病毒血癥的發(fā)生率（P≤0.000 1，圖1），糞便排毒顯著降低70.0%（P=0.000 2），免疫豬的抗體滴度均顯著提高（P≤0.005 6），淋巴衰竭減少91.2%，組織細(xì)胞浸潤減少100%，組織中檢出的PCV2抗原的數(shù)量減少77.4%（圖2）。

圖1 在試驗(yàn)過程中豬只出現(xiàn)過PCV2病毒血癥的百分比

圖2 PCV2組織分析（微觀病變和免疫組化評分）

2.2 MH攻毒試驗(yàn)

免疫后3周攻毒試驗(yàn)：選取了60頭臨床健康的雜種斷奶仔豬，大約3周齡，而且豬肺炎支原體血清陰性；將仔豬隨機(jī)分為兩組（30頭/組），即對照組（無MH抗原，只有PCV抗原）和瑞圓舒組（包含MH和PCV抗原）；在接種疫苗后3周，用10 mL含有強(qiáng)毒活MH的肺臟勻漿對豬進(jìn)行連續(xù)2 d氣管內(nèi)攻毒。每天觀察豬的整體健康狀況和呼吸困難、嗜睡等臨床癥狀，在攻毒后4周對所有豬進(jìn)行剖檢以評估肺部病變，并收集肺部拭子和組織樣本進(jìn)行MH檢測。

瑞圓舒組（1.66%）與對照組（7.01%）相比，MH病變肺臟的比例明顯降低（P≤0.000 1）；這表明免疫組比對照組的相對風(fēng)險(xiǎn)降低了76.3%（圖3）。血清學(xué)結(jié)果表明，接種前所有豬的MH抗體均為陰性（第0天），而瑞圓舒組在MH攻毒后具有記憶應(yīng)答反應(yīng)（第48天或第49天，P≤0.000 1）。

圖3 MH病變肺臟的百分比（最小平方均值）

除免疫后3周齡攻毒試驗(yàn)，還進(jìn)行了免疫后23周PCV2和MH攻毒試驗(yàn)；通過控制豬只PCV2病毒血癥、PCV2糞便排毒、淋巴組織中病毒載量、接種疫苗的血清學(xué)反應(yīng)及減輕MH引起的肺部病變的支持?jǐn)?shù)據(jù)表明，瑞圓舒中的PCV部分和MH部分均具有至少23周的免疫保護(hù)期。

3 總結(jié)

通過瑞圓舒的創(chuàng)新工藝可知，瑞圓舒是從“基礎(chǔ)”開始研發(fā)的，而不是兩種現(xiàn)有疫苗的簡單混合。在疫苗的MH組分生產(chǎn)工藝中，把富含MH抗原的液體部分中的MH細(xì)胞過濾掉，增加疫苗的安全性，并產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答；同時(shí)，通過“蛋白A”方法從MH部分中去除PCV抗體（和其他無關(guān)的IgG抗體），使兩種抗原更加兼容；而且選用MetaStim作為瑞圓舒的佐劑來生產(chǎn)一種安全和高效的聯(lián)苗。

在PCV2攻毒試驗(yàn)方面，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了瑞圓舒中PCV成分能夠幫助預(yù)防攻毒后PCV2病毒血癥、顯微病變（淋巴衰竭）及其在淋巴組織的定殖，幫助降低PCV2糞便排毒，接種后產(chǎn)生PCV2主動(dòng)的抗體應(yīng)答及攻毒后的記憶應(yīng)答；在PCV2攻毒試驗(yàn)方面，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了瑞圓舒中MH成分顯著降低了豬支原體肺炎肺部病變嚴(yán)重程度，并對于豬肺炎支原體的攻毒產(chǎn)生了顯著的記憶應(yīng)答反應(yīng)；兩者的免疫保護(hù)期均達(dá)23周之長。

總而言之，瑞圓舒是從源頭研發(fā)的圓支二聯(lián)苗，在保證有效性的情況下發(fā)揮其便利性，給養(yǎng)豬生產(chǎn)者帶來應(yīng)有的利潤。