清火片（膠囊）微生物限度檢查方法適用性試驗

夏天，崔迎，任文鑫，王愚，楊曉東

作者單位：西安市食品藥品檢驗所微生物室，陜西 西安 710000

清火片（膠囊）是由大青葉、大黃、石膏和薄荷腦四味藥材制成的中藥成方制劑，主要針對咽喉腫痛、牙痛、頭暈?zāi)垦?、口鼻生瘡、風(fēng)火目赤、便秘等癥狀，其中大青葉和大黃是主要成分。有研究表明大青葉的主要抑菌成分是黃酮類化合物，該類物質(zhì)具有直接抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與福氏志賀菌等多種微生物都有抑制作用，尤其針對金黃色葡萄球菌 ，抑制性明顯強于其他細(xì)菌；大黃的主要抑菌成分是蒽醌類化合物，對金黃色葡萄球菌具有很強的抑制性。建立適宜的微生物限度檢查方法，需要消除藥品對微生物的抑制性，而檢查方法確立的正確與否，也直接影響檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了保證清火片（膠囊）微生物限度檢查結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性，我們對清火片（膠囊）的微生物限度檢查方法進(jìn)行了確認(rèn)，本單位于 2018年 1—8月按照《中國藥典》2015 版四部（以下簡稱《藥典》）通則 1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和通則 1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法的要求，對 22 家企業(yè)生產(chǎn)的清火片（膠囊）進(jìn)行方法適用性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

清火片（膠囊）作為 2018年國家藥品評價性抽檢項目之一，本單位共收到 22 家企業(yè)生產(chǎn)的266 批次的樣品，其中清火片的生產(chǎn)企業(yè)為 21 家，清火膠囊的生產(chǎn)企業(yè)僅有 1 家。這 22 家企業(yè)均對各自生產(chǎn)的清火片（膠囊）做了微生物限度檢查方法適用性研究，并制訂了相應(yīng)的檢查方法。本實驗室收集方法材料，并整理歸納，以便對比分析。

1.2 樣品

樣品全部來自本次國抽 項目 ，共計 22家生產(chǎn)企業(yè)，每家企業(yè)選擇一批清火片（膠囊）為供試品，進(jìn)行方法適用性試驗。

1.3 條件要求

所有檢查環(huán)境設(shè)施均符合《藥典》的要求。試驗中凡是與供試品接觸的器皿在使用前均經(jīng)過 0.1 Mpa 121 ℃濕熱 滅 菌 30 min。試驗所用培養(yǎng)基、稀釋液均按照《藥典》的要求配制，所用菌種均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 主要儀器設(shè)備

LRH-250 型需氧菌培養(yǎng)箱 、MJ-Ⅱ型霉菌和酵母菌培養(yǎng)箱、LRH-250 型控制菌培養(yǎng)箱均購于上海一恒科技有限公司，SX-500 型壓力蒸汽滅菌器購于 TOMY（日本托米）公司，LFHC31 型集菌儀購于默克密理博公司。

1.5 菌種及菌液制備

菌 種 ：金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003 ］、大腸埃希菌［ CMCC（B）44102 ］、銅綠假單胞菌［ CMCC（B）10104 ］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501 ］、白色念珠菌［ CMCC（F）98001 ］、黑曲霉［ CMCC（F）98003 ］、沙門氏菌［ CMCC（B）50094 ］。

菌液制備：取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，分別用 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 10 倍遞增稀釋，制成含菌數(shù)小于 10 000 CFU∕mL的菌懸液，備用。

取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，用 3～5 mL 含 0.05%（mL∕mL）聚山梨酯 80 的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含 0.05%（mL∕mL）聚山梨酯 80的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含孢子數(shù)小于 10 000 CFU∕mL 的孢子懸液，備用。

1.6 微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)清火片（膠囊）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和《藥典》四部 1107 非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，確定清火片（膠囊）的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是：需氧菌總數(shù)不得超過 10CFU∕g；霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過 10CFU∕g；不得檢出大腸埃希菌（1 g）；不得檢出沙門菌（10 g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于 10CFU（1 g）。

1.7 計數(shù)方法適用性試驗

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：每次的試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在 0.5～2.0 范圍內(nèi)。

供試液的制備：稱取供試品 10 g，加 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（耐膽鹽革蘭陰性菌檢查用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑）至 100 mL，混勻，制成 1∶10 的供試液。

1.7.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

1.7.1.1 平皿法 清火片（膠囊）的需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗，首先采用平皿法，分別取 1∶10 供試液、1∶50 供試液、1∶100 供試液，1 毫升∕皿，對試驗組、菌液組和供試品對照組的菌數(shù)進(jìn)行測定，按照《藥典》四部通則 1105 中的規(guī)定進(jìn)行試驗，并計算供試品中微生物的回收率。

1.7.1.2 薄膜過濾法 在使用平皿法供試品試驗組的回收率達(dá)不到規(guī)定值時，則考慮采用薄膜過濾法進(jìn)行進(jìn)一步試驗。取 1∶10 供試液，1 毫升∕膜，每張濾膜每次沖洗量為 100 mL，分別沖洗 1 次、2 次，用pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，測定試驗組、菌液組和供試品對照組的菌數(shù)，按照《藥典》四部通則 1105 中的規(guī)定進(jìn)行試驗，并計算供試品中微生物的回收率。

1.7.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗采用平皿法試驗，取 1∶10 供試液，1 毫升∕皿，分別對試驗組、菌液組和供試品對照組進(jìn)行測定，按照《藥典》四部通則 1105 中的規(guī)定進(jìn)行試驗，并計算供試品試驗組的回收率。

1.7.3 控制菌方法適用性試驗 控制菌包括耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌，均采用常規(guī)法進(jìn)行方法適用性試驗。耐膽鹽革蘭陰性菌采用常規(guī)法，將 1∶10 供試液置 20～25 ℃培養(yǎng) 2 h，取相當(dāng)于 0.1 g，0.01 g，0.001 g 供試品的預(yù)培養(yǎng)物，分別接種至 10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，按照《藥典》四部 1106 規(guī)定項下方法檢查；大腸埃希菌采用常規(guī)法，取 1∶10 供試液 10 mL，接種至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按照《藥典》四部 1106 規(guī)定項下方法檢查 ；沙門菌采用常規(guī)法，取供試品 10 g，接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按照《藥典》四部1106 規(guī)定項下方法檢查，分別對陽性對照組、陰性對照組、試驗組和供試品對照組進(jìn)行試驗。

2 結(jié)果

2.1 樣品微生物限度檢查結(jié)果

本實驗室檢查結(jié)果全部符合《藥典》的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。需氧菌總數(shù)有 207批 樣品的結(jié) 果＜10 CFU∕g，32 批 次 樣品結(jié) 果在 10～100 CFU∕g，19 批次樣品的結(jié)果在＞100～1 000 CFU∕g，而僅有 8 批樣品需氧菌總數(shù)的結(jié)果＞1 000 CFU∕g。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)有 263 批 樣 品 結(jié) 果 為 ＜10 CFU∕g，僅 3 批樣品有霉菌和酵母菌生長，結(jié)果均在20～30 CFU∕g 范圍內(nèi)，控制菌檢查結(jié)果均符合規(guī)定。這為我們進(jìn)行方法適用性試驗奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2 需氧菌總數(shù)檢查方法

試驗結(jié)果顯示，供試品采用平皿法計數(shù)，金黃色葡萄球菌試驗組的回收比值不在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的 0.5～2.0 范圍內(nèi)，而銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗組的回收比值均在該范圍內(nèi)，表明清火片（膠囊）對金黃色葡萄球菌的抑制性最為顯著。而從薄膜過濾法的試驗結(jié)果看出，金黃色葡萄球菌試驗組的回收比值可以達(dá)到 0.5～2.0 之間。故清火片（膠囊）的需氧菌總數(shù)應(yīng)采用薄膜過濾法（1∶10 供試液，1 毫升∕皿，不同廠家沖洗量略有不同）計數(shù)，詳見表1。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法

試驗結(jié)果表明所有供試品的白色念珠菌和黑曲霉的比值均在 0.5～2.0 范圍內(nèi)，因此可以采用平皿法（1∶10 供試液，1 毫升∕皿）對 清火片（膠囊）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

2.4 控制菌檢查方法

所有供試品的陽性對照試驗均檢出陽性菌，陰性對照試驗均未生長，試驗組均檢出陽性菌。因此，可以采用常 規(guī)法對清火片（膠囊）進(jìn)行控制菌檢查。

2.5 小結(jié)

2018年國家評價性抽驗項目——清火片（膠囊）（共計 22 個廠家）的微生物限度檢查方法為：需氧菌總數(shù)計數(shù)采用薄膜過濾法（1∶10 供試液，取 1 毫升∕皿過濾，不同廠家的沖洗量略有不同），霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)采用平皿法（1∶10 供試液，取 1毫升∕皿），耐膽鹽革蘭陰性菌采用常規(guī)法（1∶10 供試液 20～25 ℃培養(yǎng) 2 h，取相當(dāng)于 0.1 g，0.01 g，0.001 g供試品的預(yù)培養(yǎng)物分別接種至 10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，按照《藥典》四部 1106 規(guī)定項下方法檢查），大腸埃希菌采用常規(guī)法（取 1∶10 供試液 10 mL，接種至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按照《藥典》四部 1106 規(guī)定項下方法檢查），沙門菌采用常規(guī)法（取供試品 10 g，接種至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中 ，按照《藥典》四部1106規(guī)定項下方法檢查）。

3 討論

根據(jù)各企業(yè)提供的微生物限度檢查方法，266批次清火片（膠囊）的微生物限度檢查結(jié)果全部符合 規(guī) 定 。 其中 78% 樣品的需氧菌總數(shù)結(jié)果為 0，97% 樣品的需氧菌總數(shù)在 1 000 CFU∕g 以內(nèi)，有 8 批次樣品超過 1 000 CFU∕g，最高值為 3 000 CFU∕g。檢查結(jié)果表明少數(shù)批次的清火片（膠囊）存在不同程度的微生物污染情況，影響因素可能包括：樣品的原輔料來源和質(zhì)量不同；樣品在生產(chǎn)過程和儲存環(huán)境中的溫濕度存在差異；藥材提取工藝中具體參數(shù)不盡相同；人員操作規(guī)范程度等等，這些情況都會影響樣品微生物載荷。另外，清火片（膠囊）含有藥材原粉，也會增加樣品攜帶微生物的概率。266批次樣品微生物限度檢查結(jié)果全部符合規(guī)定，從側(cè)面反映出隨著新版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的頒布與實施，國內(nèi)藥品生產(chǎn)企業(yè)在人、機、料、法、環(huán)、測等方面的管理越來越規(guī)范，衛(wèi)生水平得到提高，保障了藥品使用的安全性，這一點值得肯定。

表1 清火片需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果比較

本次試驗的結(jié)果顯示，清火片（膠囊）微生物限度檢查方法差異最大的項目是需氧菌總數(shù)計數(shù)，僅1 家企業(yè)生產(chǎn)的清火片與企業(yè)提供的試驗方法相同，其余 21 家企業(yè)提供的計數(shù)法為平皿法，而本單位驗證結(jié)果為薄膜過濾法。分析這種差異的原因，可能有以下幾個方面：各實驗室菌種來源、保藏和傳代情況不同，導(dǎo)致菌種活力上的差異；供試液制備時的溫度、加熱方式與保溫時間不同，導(dǎo)致供試液藥物有效成分含量的差異；另外操作人員、儀器耗材與環(huán)境的不同也可能引起不同的試驗結(jié)果。21 家企業(yè)生產(chǎn)的清火片的微生物限度檢查法在本實驗室未得到重現(xiàn)，這種情況值得關(guān)注。

整理本單位收集到的所有清火片（膠囊）微生物限度檢查方法材料，發(fā)現(xiàn)一些不規(guī)范的情況。第一，白 色念珠菌與黑曲霉既要作為 需氧菌總數(shù)用TSA 進(jìn)行計數(shù)方法性試驗，也要作為霉菌和酵母菌總數(shù)用 SDA 進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗，二者缺一不可。第二，控制菌的方法適用性試驗必須做陽性對照試驗，有的企業(yè)只做了試驗組和陰性對照組，并未做陽性對照試驗。

各廠家產(chǎn)品需氧菌總數(shù)計數(shù)采用的薄膜過濾法，沖洗量略有不同，這可能是由于各個廠家的原料來源不同，成品中有效成分含量存在差異，導(dǎo)致抑菌活性有所不同。

清火片的成分是大青葉、大黃、石膏、薄荷腦，輔料為淀粉，其中大青葉和大黃兩味藥材是主要成分，有研究表明大青葉對細(xì)菌的抑制性相對較強，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑制效果更為明顯，大黃對金黃色葡萄球菌也有很強的抑制性。本次清火片微生物限度檢查驗證試驗中，發(fā)現(xiàn)采用平皿法對清火片需氧菌總數(shù)進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗時，金黃色葡萄球菌的試驗組回收比值不能達(dá)到規(guī)定范圍，而在改用薄膜過濾法后，金黃色葡萄球菌的試驗組回收率均達(dá)到規(guī)定值。不難看出，清火片（膠囊）對金黃色葡萄球菌的抑制作用最為顯著，恰恰印證了上述研究結(jié)論。