廖梅 ,陳小平 ,蒙其其
作者單位:1 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,廣東 梅州 514031;2 廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 梅州 514031
急性腮腺炎為常見的呼吸道傳染病,主要由腮腺病毒引起。該病的臨床表現(xiàn)以腮腺非化膿性炎癥和腮腺區(qū)腫痛為主,冬季和春季發(fā)病率較高,多發(fā)于兒童和青少年,臨床上多以對(duì)癥治療為主,兼顧抗病毒治療的方法進(jìn)行干預(yù)治療。復(fù)方仙人掌軟膏是我院的自制制劑,主要由仙人掌總黃酮 30份、青黛 6 份、冰片 1 份和軟膏基質(zhì)構(gòu)成,以三氯叔丁醇為防腐劑、月桂氮酮為促滲透劑、維生素 C 為抗氧化劑,用于急性腮腺炎的輔助治療,臨床療效較好。實(shí)踐證明仙人掌汁液外敷或與青黛、冰片合用治療腮腺炎療效顯著。仙人掌性味苦寒,具有清熱解毒,散瘀消腫,健胃止痛,鎮(zhèn)咳的功效,仙人掌總黃酮可以明顯抑制腫脹反應(yīng)及增加毛細(xì)血管通透性,可減輕局部炎癥反應(yīng),其活性大小與總黃酮的劑量呈正相關(guān),輔助治療流行性腮腺炎。青黛性味咸寒,具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚、抗炎 鎮(zhèn)痛等功效。青黛的抗炎鎮(zhèn)痛作用能夠有效緩解腮腺疼痛,其抗病毒作用則能有效對(duì)抗腮腺炎病毒。冰片具有通諸竅 ,散郁火,消腫止痛的功效,能夠有效減輕腮腺炎所致的腫脹及疼痛。為了提高病人用藥的依從性,保證制劑的工藝和質(zhì)量穩(wěn)定,確保臨床用藥安全,本實(shí)驗(yàn)于 2019年 6―12月優(yōu)化復(fù)方仙人掌軟膏的制備工藝并測(cè)定其總黃酮含量,初步評(píng)價(jià)該軟膏劑質(zhì)量,為該劑型的后續(xù)研究開發(fā)提供參考。
1.1 儀器
MS103DU 電子分析天平(梅特勒-托利多);KDC-140HR 型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳公司);Zetasizer Nano ZS90 粒度及電位測(cè)定儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司);85-2型恒溫磁力攪拌器(金壇市新航儀器廠)。1.2 材料
化妝品級(jí)液體石蠟(批號(hào) P823840)、醫(yī)用級(jí)白凡士林(批號(hào) V820408)、藥用級(jí)水溶性月桂氮酮(批號(hào) A800359)、藥用級(jí)甘油(批號(hào) G810575)、藥用級(jí)十二烷基硫酸鈉(批號(hào) S817788)、藥用級(jí)三乙醇胺(批號(hào) T819271)、藥用級(jí)維生素 C(批號(hào)A800295)、藥用級(jí)硬脂酸(批號(hào) S817777)、藥用級(jí)單硬脂酸甘油酯(批號(hào) S818124)、藥用級(jí)三氯叔丁醇(批號(hào) T832418)和藥用級(jí) AB-8 大孔吸附樹脂(批號(hào)A875381)均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司;蘆?。ㄅ?hào) B20771,純度≥98%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;其它試劑均為分析純。食用仙人掌干品(批號(hào) 201910501)購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng),經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院張正偉副主任中藥師鑒定為 米邦塔仙人掌Opuntia Milpa
Alta,青黛(批號(hào)1001818)和冰片(批號(hào) 1001903)由廣東恒祥藥業(yè)股份有限公司提供,經(jīng)鑒定符合中國(guó)藥典 2015年版相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。2.1 仙人掌總黃酮的提取及純化
取仙人掌粗粉5.0 kg,加入 10 倍量 70% 乙醇浸泡 30 min,回流提取2 h,過濾,濾渣重復(fù)提取 1 次,過濾,合并 2 次提取液,提取液經(jīng)減壓濃縮至密度為 1.02~1.03 g∕mL(按總生藥量計(jì)為 0.5 g∕mL),備用。取 AB-8 大孔吸附樹脂裝柱(5 cm×50 cm),預(yù)處理后,將上述提取液以1 BV∕h 進(jìn)行上柱、吸附,用 1% 三氯化鐵乙醇溶液檢測(cè)流出液,待反應(yīng)呈陽(yáng)性停止上樣。依次用 5 倍柱體積的水、30% 乙醇、70% 乙醇以 1 BV∕h 進(jìn)行洗脫,收集 70% 乙醇洗脫液,經(jīng)適當(dāng)減壓濃縮后冷凍干燥,得到棕色粉末 105 g,即為仙人掌總黃酮,備用。2.2 軟膏基質(zhì)的制備
按基質(zhì)處方量分別稱取油相、水相于燒杯中,在水浴鍋中加熱至 75 ℃,攪拌均勻;控制水相溫度高于油相溫度 2~3 ℃,維持油相溫度在 75 ℃下將水相緩慢加入到油相中,攪拌均勻,置磁力攪拌器中攪拌 5 min 至冷凝。2.3 處方評(píng)價(jià)方法
2.3.1 外觀評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)采用多人評(píng)分取平均值的形式對(duì)軟膏的色澤均勻度、質(zhì)地細(xì)膩度、涂抹分散性、清洗容易度進(jìn)行評(píng)分,各占 10 分,總分 40分。評(píng)分細(xì)則:8~10 分表示色澤均勻,細(xì)膩無顆粒感,易涂抹和清洗;5~7 分表示均勻度一般,有稍微顆粒感,較難涂抹和清洗;4 分以下表示不均勻,存在明顯色塊,粗糙有顆粒感,難以涂抹清洗。
2.3.2 離心穩(wěn)定性試驗(yàn) 取基質(zhì) 3 g 置于 10 mL 離心管中,2 500 r∕min 離心 30 min 后取出,涂抹于載玻片上 ,觀察其有無油水分層 、破乳及變粗等現(xiàn)象。10 分以下為出現(xiàn)變粗、破乳、油水分層等顯著異?,F(xiàn)象;10 分以上無顯著異?,F(xiàn)象,總分 20 分。
2.3.3 耐寒耐熱試驗(yàn) 取基質(zhì) 3 g 裝入密閉的塑料盒中,分別置于-18 ℃冰箱中靜置 24 h 和 55 ℃烘箱中恒溫 6 h,取出觀察樣品是否出現(xiàn)變粗、破乳以及油水分層等現(xiàn)象。10 分以下為出現(xiàn)變粗、破乳、油水分層等顯著異常現(xiàn)象;10 分以上無顯著異?,F(xiàn)象,總分為耐寒試驗(yàn)與耐熱試驗(yàn)各 20 分。
2.4 基質(zhì)配比篩選
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,參考其他中藥軟膏劑基質(zhì)中油相、水相和乳化劑的用量,暫擬定 6種不同的基質(zhì)處方(見表1),制備軟膏基質(zhì),以“2.3”項(xiàng)下內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)果顯示處方 5 評(píng)分最高,因此,選定處方 5 作為待考察基質(zhì)處方。然后對(duì)基質(zhì)成型性影響較大的硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三乙醇胺和十二烷基硫酸鈉用量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察。固定基質(zhì)中其他成分的用量不變,改變 1 種成分的用量,并按“2.2”項(xiàng)下方法制備軟膏基質(zhì)。以“2.3”項(xiàng)下內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)選每個(gè)因素的最佳用量范圍。單因素結(jié)果顯示當(dāng)硬脂酸用量為 1.0 g、3.0 g、5.0 g,單硬脂酸甘油酯用量為 1 g、1.5 g、2.0 g,三乙醇胺用量為 0.12 g、0.14 g、0.16 g,十二烷基硫酸鈉用量為 0.10 g、0.12 g、0.14 g 時(shí),均能形成表面光滑、均勻細(xì)膩、涂布性能好、易于清洗且穩(wěn)定性較好的軟膏基質(zhì),符合軟膏劑基本質(zhì)量要求。2.5 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素考察結(jié)果,選取硬脂酸(A)、單硬脂酸甘油酯(B)、三乙醇胺(C)和十二烷基硫酸鈉(D)的用量為考查要素,按 L(3)因素水平表(見表2),進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),以“2.3”項(xiàng)下內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算并比較綜合評(píng)分,篩選軟膏最優(yōu)處方組成及用量,結(jié)果見表3,4。從表4中直觀分析的R
值可得,A、B、C、D 四個(gè)因素對(duì)軟膏成型的影響大小為 A > D > C > B,最佳基質(zhì)處方用量為 ABCD。表5 方差分析結(jié)果顯示,A、B、C 和 D因素即硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三乙醇胺和十二烷基硫酸鈉的用量對(duì)軟膏成型性的綜合評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
<0.05)。因此,綜合分析確定軟膏的最優(yōu)處方組成為 ABCD。即硬脂酸用量為 1 g、單硬脂酸甘油酯用量為 1 g,三乙醇胺用量為 0.16 g、十二烷基硫酸鈉用量為 0.14 g。表1 復(fù)方仙人掌軟膏制備基質(zhì)處方篩選結(jié)果∕g
表2 復(fù)方仙人掌軟膏制備正交實(shí)驗(yàn)因素水平表∕g
表3 復(fù)方仙人掌軟膏制備 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表4 復(fù)方仙人掌軟膏制備直觀分析結(jié)果
表5 復(fù)方仙人掌軟膏制備方差分析結(jié)果
2.6 乳化溫度和時(shí)間的確定
報(bào)道顯示軟膏劑的乳化溫度一般為70~95 ℃,乳化時(shí)間一般為 5~10 min。按照最佳基質(zhì)處方用量制備軟膏基質(zhì),考察不同乳化溫度和時(shí)間對(duì)軟膏基質(zhì)成型性的影響,以“2.3”項(xiàng)內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)合粒徑大小和分散性系數(shù)(PDI 值)綜合分析。結(jié)果顯示乳化溫度為 75 ℃和 85 ℃時(shí)制得的軟膏外觀均勻細(xì)膩、易涂抹、易清洗;乳化溫度為 90 ℃時(shí)軟膏較難清洗和涂抹,膚感較差;乳化溫度為 75 ℃、乳化時(shí)間為 5 min 時(shí)制備的軟膏粒徑和 PDI 值較小,細(xì)膩松軟,有光澤,外觀良好。因此,選擇乳化溫度 75 ℃,乳化時(shí)間 5 min。2.7 復(fù)方仙人掌軟膏的制備
分別稱取硬脂酸 1.0 g、單硬脂酸甘油酯 1.0 g、液體石蠟 3.0 g、白凡士林1.5 g 于燒杯中,作為油相;另稱取甘油 3.0 g、十二烷基硫酸鈉 0.14 g、三乙醇胺 0.16 g、三氯叔丁醇 0.15 g、月桂氮酮 0.15 g、純化水 19.85 g,作為水相。精密稱取 1.5 g 仙人掌總黃酮加入到水相中,0.3 g 青黛研磨成極細(xì)粉后加入到油相中。將水相與油相分別在 75 ℃下攪拌至混勻,維持油相溫度在 75 ℃,將水相緩緩加入到油相中,待基質(zhì)冷至 40 ℃時(shí)加入用0.5 mL 無水乙醇溶解的冰片 0.05 g 和維生素 C 細(xì)粉0.05 g,邊加邊攪拌,置磁力攪拌器中繼續(xù)攪拌至冷凝,即得淺灰色軟膏。2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及初步質(zhì)量評(píng)價(jià)
采用最佳處方配比,放大 10 倍量,按“2.7”項(xiàng)下方法分別制備復(fù)方仙人掌軟膏,共制備 3 批,按“2.3”項(xiàng)下的評(píng)價(jià)方法對(duì)軟膏色澤均勻度、質(zhì)地細(xì)膩度、涂抹分散性、清洗容易度和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果見表6,三批驗(yàn)證試驗(yàn)所制備的軟膏細(xì)膩均勻,無粗糙感,膏體松軟,稠厚適中,有光澤,易涂展,質(zhì)量穩(wěn)定。稱取 1 g 軟膏于燒杯中,蒸餾水稀釋 400 倍,混勻呈淺灰色液體,粒徑測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示軟膏劑平均粒徑為 633.5 nm,PDI 為 0.531,表明該軟膏的平均粒徑較小、分布均勻,符合軟膏劑粒徑要求。
2.9 復(fù)方仙人掌軟膏總黃酮的含量測(cè)定
2.9.1 總黃酮測(cè)定方法 參照文獻(xiàn)[19],取一定體積的樣品溶液置于 25 mL 容量瓶中,加 70% 乙醇至6 mL,加 5% 亞硝酸鈉溶液 1 mL,搖勻,放置 6 min,加 10% 硝酸鋁溶液 1 mL,搖勻,放置 6 min,加 4% 氫氧化鈉溶液 10 mL,加 70% 乙醇至刻度,搖勻,放置15 min,以不加仙人掌總黃酮的空白制劑按上述操作得到空白溶液,在 510 nm 處測(cè)定溶液吸光度。
2.9.2 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品 25 mg 精密稱定,置 25 mL 容量瓶中,加 70% 乙醇適量,超聲30 min 使其完全溶解,放冷至室溫,70% 乙醇定容至刻度,即得 1 g∕L 的對(duì)照品溶液。
2.9.3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方仙人掌軟膏 5.0 g,加入 70% 乙醇 80 mL,水浴回流 1 h,微孔濾膜過濾至 100 mL 量瓶中,加 70% 乙醇稀釋至刻度,作為供試品溶液,精密量取該供試品溶液 1 mL置于 25 mL 容量瓶中按“2.9.1”項(xiàng)下步驟測(cè)定分析。
2.9.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液 0 mL,0.25 mL,0.5 mL,1 mL,1.5 mL,2 mL,2.5 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中,按“2.9.1”方法進(jìn)行測(cè)定。以第一瓶溶液作為空白對(duì)照調(diào)零,以蘆丁濃度C
為橫坐標(biāo),吸光度A
為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:A
=11.546C
+0.009 6,R
2=0.999 5。結(jié)果表明蘆丁在 0.01~0.10 g∕L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。表6 復(fù)方仙人掌軟膏制備驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.9.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液 1 mL 置于 25 mL 容量瓶中,連續(xù)測(cè)定 6 次吸光度,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。結(jié)果顯示其 RSD 為 0.45%,結(jié)果表明該方法儀器精密度符合分析要求。
2.9.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次(1901)軟膏樣品 6份,按照“2.9.3”項(xiàng)下同法操作,測(cè)定各樣品的吸光度,計(jì)算其總黃酮含量。結(jié)果顯示其計(jì)算值的 RSD值為 2.05%(n
=6),說明該方法重復(fù)性良好。2.9.7 回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量的軟膏 2.5 g,平行稱定 6 份,加入對(duì)照品適量,按照“2.9.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,計(jì)算其加樣回收率。結(jié)果顯示,總黃酮的平均加樣回收率為93.60%,RSD 值 為2.40%(n
=6),表明該方法準(zhǔn)確可行。見表7。表7 復(fù)方仙人掌軟膏總黃酮的含量測(cè)定回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.9.8 含量測(cè)定 分別稱取各批次樣品 5.0 g,按照“2.9.3”項(xiàng)下制備供試品溶液,平行制備 3 份,依法測(cè)定并計(jì)算其含量。3 批樣品的總黃酮量含量分別為(32.62±0.15)、(33.19±0.23)、(31.46±0.09)mg∕g,平均含量為(32.42±0.77)mg∕g,其 RSD 值 為 2.39%,結(jié)果表明該方法制備的軟膏質(zhì)量穩(wěn)定。見表8。
表8 復(fù)方仙人掌軟膏總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)
軟膏劑具有涂展性和黏附性良好、安全、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)皮給藥相對(duì)較為安全,病人的用藥依從性較高,不良反應(yīng)發(fā)生少,在治療流行性腮腺炎時(shí),能夠持續(xù)對(duì)腮腺部位產(chǎn)生長(zhǎng)效作用。在 O∕W 型乳膏劑基質(zhì)中,多選擇十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、聚山梨酯 80 作為乳化劑。本實(shí)驗(yàn)從 6 種較為常用的軟膏基質(zhì)處方篩選出十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺合用作為乳化劑。在考察乳化溫度和乳化時(shí)間發(fā)現(xiàn),乳化溫度為 90℃時(shí),乳化時(shí)間為 5 min、10 min、20 min 時(shí)制備的軟膏難以清洗和涂抹,黏稠度大。推測(cè)原因?yàn)樵诖帕嚢杵鞯淖饔孟?,隨著溫度和時(shí)間的增加,基質(zhì)中的水份逐漸減少,乳化程度逐漸增大所致。
本實(shí)驗(yàn)在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計(jì)法確定最佳基質(zhì)處方,同時(shí)考察乳化溫度和時(shí)間對(duì)基質(zhì)成型性的影響,對(duì)復(fù)方仙人掌軟膏進(jìn)行制備工藝優(yōu)化,最終得到淺灰色軟膏。質(zhì)量評(píng)價(jià)研究表明該法制備的軟膏細(xì)膩均勻、質(zhì)量穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)確定了復(fù)方仙人掌軟膏的制備工藝并初步評(píng)價(jià)該軟膏劑質(zhì)量,進(jìn)一步擴(kuò)大和開發(fā)了仙人掌的藥用價(jià)值,為該制劑的后續(xù)開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。