滇老鸛草藥材鑒別方法改進(jìn)

黃云先 趙健勝 曹云蕓

麗江市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 麗江 674100

滇老鸛草來源于牻牛兒苗科植物滇老鸛草GeraniumnepalenseSweet干燥地上部分。別名老鸛草、五葉草、老官草、六陽草、五瓣草、貓腳跡、老觀草[1]、尼泊爾老鸛草[2]。老鸛草來源于牻牛兒苗科的兩屬植物，即牻牛兒苗屬和老鸛草屬的不同植物[4]。牻牛兒苗屬植物我國(guó)約有四種，老鸛草屬植物我國(guó)約有55種，云南省約產(chǎn)21種?！对颇鲜≈兴庯嬈瑯?biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊(cè)收載的滇老鸛草為尼泊爾老鸛草GeraniumnepalenseSweet。老鸛草屬植物全草富含老鸛草鞣質(zhì)，干葉含老鸛草鞣質(zhì)、金絲桃苷，又含類沒食子酸、琥珀酸、鈣鹽、甜菜堿[3]、黃酮類槲皮素、山奈酚[2]等，《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊(cè)·彝族藥中對(duì)滇老鸛草的鑒別對(duì)照藥材薄層色譜鑒別，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]，通過對(duì)云南省麗江古城區(qū)和玉龍縣5個(gè)批次的滇老鸛草樣品做了顯微鑒別及專屬性較強(qiáng)的成分沒食子酸的薄層色譜鑒別，以建立一個(gè)專屬性更強(qiáng)的鑒別方法，從而達(dá)到控制滇老鸛草藥材質(zhì)量的目的。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 德國(guó)塞多利斯BT224S電子分析天平；梅特勒MS205DU電子分析天平；Purelab Flex 超純水機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 試藥試劑 沒食子酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201906)；老鸛草對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121557-201102)；三氯甲烷、甲酸乙酯 、甲酸、甲醇、、乙醇、乙酸乙酯環(huán)己烷、丙酮、正丁醇(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；水(實(shí)驗(yàn)室自制UP水，Ω=18.3); 硅膠GF254薄層板(青島海洋化工)；硅膠G薄層板(青島海洋化工)；硅膠G薄層板(美國(guó)莫克)。

1.2.2 樣品來源 采集麗江市玉龍縣、古城區(qū)不同五個(gè)地方的樣品共5個(gè)：

D1. 2015年9月，采收于麗江市玉龍縣白沙鄉(xiāng)玉湖村，為野生品種；為干燥地上部分。標(biāo)本為全株(大樣)。

D2. 2015年6月，采收于麗江市古城區(qū)祥云街道辦事處吉祥社區(qū)，為野生品種；為干燥地上部分。

D3. 2015年9月，采收于麗江市玉龍縣黎明鄉(xiāng)黎明村，為野生品種；為干燥地上部分。標(biāo)本為全株(溯源小樣)。

D4. 2015年7月，采收于麗江市玉龍縣拉市鄉(xiāng)，為野生品種；為干燥地上部分。

D5. 2015年5月，采收于古城區(qū)束河街道辦開文社區(qū)九子海，為野生品種；為干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別(改進(jìn)自擬方法) 本品莖橫切面 表皮由2～3列薄壁細(xì)胞組成，皮層為數(shù)列細(xì)胞，內(nèi)側(cè)厚壁細(xì)胞環(huán)明顯，維管束8～9個(gè)，外韌型，呈輻射狀排列；形成層不明顯，韌皮部寬廣，木質(zhì)部狹小，導(dǎo)管散列其中。薄壁細(xì)胞中草酸鈣簇晶眾多。

粉末顯微特征：本品粉末灰綠色。草酸鈣簇晶眾多而小，直徑10～20 μm。氣孔多為不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)。非腺毛1～4細(xì)胞，基部細(xì)胞稍寬，尖端較長(zhǎng)；腺毛短小，頭部圓形或橢圓形，腺柄1～4個(gè)細(xì)胞組成。螺紋導(dǎo)管多見；可見淀粉粒，多為單粒球形散在。見粉末顯微圖2A～F。

2.2 薄層鑒別(改進(jìn)自擬方法) 取本品LO1到LO5號(hào)粉末(過四號(hào)篩)1 g，加水100 mL，加熱煎煮30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取三次，每次20 mL，取乙酸乙酯液水浴(60 ℃)上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取滇老鸛草對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取沒食子酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法《中國(guó)藥典》第四部附錄試驗(yàn)，分別吸取上述兩種溶液各5 μL和10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯 -甲酸(5∶5∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)色的斑點(diǎn)。不同點(diǎn)樣量的薄層圖如圖3所示。

3 分析方法驗(yàn)證

3.1 樣品溶液制備試驗(yàn)篩選 方法1：分別取本品粉末0.3 g和0.5 g(過四號(hào)篩)，加甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法2：分別取本品粉末0.3 g和0.5 g(過四號(hào)篩)，加乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法3：取本品粉末0.5 g，加70%甲醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法4：取本品粉末0.5 g，加70%乙醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法5：取本品粉末0.5 g，加50%甲醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法6：取本品粉末0.5 g，加50%乙醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法7：取本品粉末0.5 g，加30%甲醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法8：取本品粉末0.5 g，加30%乙醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法9：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱煎煮30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

方法10：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

方法11：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

方法12：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱煎煮30 min，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

通過實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)方法9操作可行性高，分離效果良好，方法驗(yàn)證效果良好，決定選用方法9中取1 g的方法為最終供試品制備方法。

3.2 展開劑篩選 展開劑1：乙酸乙酯-甲醇 -水(8∶5∶0.2)；

展開劑2：乙酸乙酯-甲醇 -水(8∶5∶2)的下層溶液；

展開劑3：三氯甲烷-甲醇-水(8∶5∶0.2)；

展開劑4：環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶2.5∶1)；

展開劑5：三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)；

展開劑6：三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.8)；

展開劑7：甲苯(水飽和)-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)；

展開劑8：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)；

展開劑9：正己烷-甲醇(1∶ 9) ；

展開劑10：正己烷-乙酸乙酯(1∶4)。

飽和10 min，上行展開。

通過比對(duì)用展開劑6號(hào)展開時(shí)RF值為0.37，在0.2～0.8藥典規(guī)定的范圍，展開效果好。

3.3 檢視方法的選擇 噴以10%磷鉬酸顯色；噴以2%三氯化鐵50%的乙醇溶液；噴以5%氯化鐵乙醇液；紫外光燈(365 nm)下檢視；噴以5%三氯化鐵乙醇液，再在紫外光燈(365 nm)下檢視。選用上述5種方法檢視，第三種斑點(diǎn)清晰且方法簡(jiǎn)便。

3.4 點(diǎn)樣方式及點(diǎn)樣量考察 點(diǎn)樣方式為接觸點(diǎn)樣；點(diǎn)樣量為2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL。溫度及相對(duì)濕度的影響 按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察本品在溫度5～30 ℃、相對(duì)濕度10%～75%展開時(shí)，對(duì)薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述溫度、濕度范圍內(nèi)對(duì)該薄層色譜結(jié)果無明顯影響，點(diǎn)樣量為10 μL斑點(diǎn)效果好。

3.5 預(yù)平衡試驗(yàn) 按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察未平衡、平衡15 min、平衡30 min展開，對(duì)薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，未平衡的展開邊緣效應(yīng)較明顯，平衡15 min與平衡30 min展開，所得分離度均較好，且無明顯差異。因此采用預(yù)平衡15 min展開。

3.6 重復(fù)性 不同產(chǎn)地的5批次樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法具有重復(fù)性。

4 討論

4.1 顯微鑒別方法建立 顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、而特異性較強(qiáng)，可以說利用顯微特征對(duì)比鑒定對(duì)大多數(shù)中藥材都行之有效。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，滇老鸛草也不例外，的確具有其顯著的特異性。

4.2 引進(jìn)代表性對(duì)照品 民族藥標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)階段整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平較低，仍多集中于藥材基源及性狀鑒定的研究，尚未建立指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制，原標(biāo)準(zhǔn)未引進(jìn)代表性對(duì)照品進(jìn)行定性。通過大量查找資料，考慮滇老鸛草的傳統(tǒng)主要功效為止瀉止血，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，老鸛草屬植物主要含鞣質(zhì)類沒食子酸、黃酮類槲皮素、山奈酚等，故考慮引進(jìn)沒食子酸作為其代表性成分研究制定薄層色譜鑒別方法。

4.3 薄層鑒別方法建立 依據(jù)沒食子酸易溶于水、醇和醚；具有酚(易被氧化和三氯化鐵水溶液生成藍(lán)黑色沉淀)及羧酸(加熱時(shí)失去二氧化碳成焦性沒食子酸)的性質(zhì)。試驗(yàn)考察了采用不同取樣量，選用水及不同比例的甲醇和乙醇采用超聲、加熱煎煮及回流提取方法，跟著考察了水提的提取液再用不同的有機(jī)溶劑乙酸乙酯、正丁醇及水飽和正丁醇提取的多種方法做對(duì)比，最終實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證采用方法9提取效果較好，能有效的提出沒食子酸。

展開劑的選擇在使用不引入甲酸的展開劑如1～4號(hào)及9號(hào)10號(hào)展開時(shí)，有的在原點(diǎn)形成堆積或展開不上去，用7號(hào)及8號(hào)展開劑展開，結(jié)果斑點(diǎn)不太清晰，5號(hào)和6號(hào)展開劑的選擇參考了《中國(guó)藥典》2015版中五倍子中鞣質(zhì)類成分沒食子酸薄層鑒別方法中的三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1，V/V/V)。實(shí)驗(yàn)考察了展開劑中甲酸比例對(duì)展開效果的影響，結(jié)果是6號(hào)展開劑三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.8，V/V/V)展開能使沒食子酸處于游離狀態(tài)，斑點(diǎn)分離效果好，Rf值適中，且無拖尾現(xiàn)象。

最終采用方法9制備供試品溶液，硅膠G薄層板，點(diǎn)樣量10 μL，以展開劑6號(hào)15 mL為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇液，所得薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好，易判斷結(jié)果，且重現(xiàn)性好。

5 結(jié)論

此次實(shí)驗(yàn)新擬的顯微鑒別方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，建議標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加顯微鑒別。薄層色譜條件可行有效，原標(biāo)準(zhǔn)中鑒別項(xiàng)下未引進(jìn)代表性對(duì)照品進(jìn)行定性，考慮引進(jìn)沒食子酸作為其代表性成分，建議標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加現(xiàn)擬方法，應(yīng)與沒食子酸對(duì)照品及滇老鸛草對(duì)照藥材色譜相同?？梢娨詻]食子酸作為滇老鸛草藥材標(biāo)識(shí)性成分有其合理性?？捎糜诘崂消X草藥材的質(zhì)量控制，以提高民族藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也可用于制定滇老鸛草對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)研制的起草。